Ang mga pestisidyo adunay hinungdanong papel sa pagsulbad sa kakulang sa pagkaon sa kalibutan ug pagbatok sa mga sakit nga dala sa mga vector sa tawo. Bisan pa, ang nagkadako nga problema sa resistensya sa pestisidyo nanginahanglan dayon sa pagdiskobre sa mga bag-ong compound nga nagtumong sa mga target nga wala magamit. Ang mga channel sa insect transient receptor potential (TRPV)—Nanzhong (Nan) ug inactive (Iav)—mahimong magporma og heterologous channels (Nan-Iav) ug mo-localize sa mga mechanosensory organ nga nagpataliwala sa geotropism, hearing, ug proprioception sa mga insekto. Ang ubang mga pestisidyo, sama sa aphidopyrrolidone (AP), nagtumong sa Nan-Iav pinaagi sa wala mahibal-i nga mga mekanismo. Ang AP epektibo batok sa mga insekto nga nagsuso (hemipterans), nga nagpugong sa pagkaon pinaagi sa pagsamok sa function sa mga filament. Ang AP makagapos lamang sa Nan, apan ang Nan-Iav lamang ang makapakig-uban sa mga agonist, lakip ang endogenous nicotinamide (NAM), sa ingon nagpakita sa channel activity. Bisan pa sa potensyal sa Nan-Iav isip target sa insecticide, gamay ra ang nahibal-an bahin sa channel assembly niini, regulatory binding sites, ug Ca2+-dependent regulation, nga nakababag sa dugang nga pag-uswag sa insecticide. Niini nga pagtuon, gigamit ang cryo-electron microscopy aron mahibal-an ang istruktura sa Nan-Iav sa mga insekto sa Hemiptera sa estado nga walay calmodulin-ligand, ingon man sa AP ug NAM sa utlanan sa ankyrin repeat cytoplasmic domain (ARD). Natingala kami nga among nakita nga ang protina sa Nan mismo mahimong moporma og pentamer, nga gipalig-on sa mga interaksyon sa ARD nga gipaagi sa AP. Kini nga pagtuon nagpadayag sa mga interaksyon sa molekula tali sa mga insecticide ug agonist ug Nan-Iav, nga nagpasiugda sa kamahinungdanon sa ARD sa pag-andar ug pag-assemble sa channel, ug pagsuhid sa mekanismo sa regulasyon sa Ca2+.
Taliwala sa nagkagrabe nga pagbag-o sa klima sa kalibutan, ang nagkagrabe nga seguridad sa pagkaon sa kalibutan usa sa mga dagkong hagit sa ika-21 nga siglo, nga adunay sunod-sunod nga mga sangputanan alang sa katilingban.1,2Ang report sa State of Food Security and Nutrition in the World 2023 (SOFI) sa World Health Organization nagbanabana nga gibana-bana nga 2.33 bilyon nga mga tawo sa tibuok kalibutan ang nag-antos sa kasarangan ngadto sa grabe nga kawalay seguridad sa pagkaon, usa ka dugay na nga problema.3,4Subo lang, gibanabana nga 20% ngadto sa 30% o labaw pa sa abot sa tanom ang mawala kada tuig tungod sa mga peste ug mga pathogen, ug ang pag-init sa kalibutan gilauman nga mograbe ang resistensya sa peste ug kahuyang sa tanom.4,5,6,7,8Ang pagpalambo sa pestisidyo importante dili lamang aron mapanalipdan ang mga tanom gikan sa mga peste ug makunhuran ang pagkaylap sa mga pathogen nga dala sa vector, apan aron usab masumpo ang mga sakit nga dala sa vector sa tawo sama sa dengue fever, malaria, ug Chagas disease, nga nagkadaghan ang resistensya sa mga pestisidyo.5,9,10,11
Lakip sa mga nag-unang target sa mga neurotoxic insecticide, ang heterotetrameric TRPV channel nga Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) nagrepresentar sa usa ka klase sa mga target sa insecticide nga nadiskobrehan lamang sa miaging dekada, lakip ang mga komersyal nga mabatonan nga insecticide sama sa imidacloprid ug pyraclostrobin.12,13,14Ang semisynthetic insecticide nga aphidopyrrolifen (AP) usa ka bag-o lang naugmad ug gikomersyalisa nga produkto kansang pangunang sangkap mao ang aktibong insecticide nga Inscalis®, nga motapot sa AP sa lebel sa kalihokan nga subnanomolar.15Ang AP nagpakita og ubos nga acute toxicity sa mga pollinator, mapuslanong mga insekto, ug uban pang dili target nga mga organismo, ug kon gamiton sumala sa mga instruksyon sa label, kini makapakunhod sa resistensya sa ubang mga insecticide.16,17,18Ang Nan ug Iav kay kaylap nga nagkatag sa mga espisye sa insekto, dungan nga gipahayag lamang sa chordal stretch receptor neurons sa antennae ug mga bukton, ug kritikal sa pandungog, persepsyon sa grabidad, ug proprioception.13,16,19,20,21,22Ang AP, imidacloprid, ug pyraclostrobin nagpadasig sa Nan-Iav complex pinaagi sa usa ka talagsaon nga mekanismo, nga sa katapusan nagpugong sa proprioceptive signal transduction.13,16,23Sa mga insekto nga mosuyop og tusok (hemipterans) sama sa aphids ug whiteflies, ang pagkawala sa proprioception makadaot sa ilang abilidad sa pagkaon, nga sa katapusan mosangpot sa kamatayon.13,24Makapainteres nga ang AP nagpakita og taas nga affinity para sa Nan-Iav complex ug ubos nga affinity para sa Nan lamang. Ang pagbugkos sa AP sa Nan-Iav nag-induce og electrical current, apan ang pagbugkos sa Nan lamang dili maka-stimulate sa channel activity. Ang Iav mismo wala gyud magbugkos sa AP.16Kini nagsugyot nga ang Nan ug Iav mahimong motapot aron maporma ang lain-laing mga Nan-Iav channel complex (pananglitan, nga adunay lain-laing mga stoichiometric ratio o lain-laing mga kahikayan sulod sa parehas nga stoichiometric ratio) o nga ang AP mahimong motapot sa daghang mga site. Dugang pa, ang natural agonist nicotinamide (NAM) motapot sa Drosophila Nan-Iav nga adunay micromolar affinity, nga nagpakita sa mga epekto nga susama sa mga aphids (AP) in vitro.16,25ug pagpugong sa pagpanganak ug pagpakaon sa mga aphid, nga sa katapusan mosangpot sa ilang kamatayon25,26. Kining mga datos nagpatunghag daghang pangutana. Pananglitan, nagpabilin nga dili klaro kon giunsa pagkaporma ang Nan-Iav heterodimer, unsang mga binding site ang gigamit sa pag-modulate sa gagmay nga mga molekula, ug kon giunsa niining gagmay nga mga molekula pag-regulate sa channel function pinaagi sa pagpugong sa proprioception. Dugang pa, ang mga hinungdan nganong ang Nan mismo dili aktibo ug adunay ubos nga affinity sa AP, samtang ang Nan-Iav heterodimer aktibo ug nagbugkos sa AP nga adunay mas taas nga affinity, nagpabilin nga dili klaro. Sa katapusan, gamay ra ang nahibal-an bahin sa Ca2+-dependent regulation sa Nan-Iav function ug kon giunsa kini gi-integrate sa neuronal signaling processes.. 13,21
Niini nga pagtuon, nga naghiusa sa cryo-electron microscopy, electrophysiology, ug radioligand binding techniques, among gipatin-aw ang pag-assemble sa Nan-Iav ug ang mekanismo sa pag-assemble niini sa mga small molecule regulators. Dugang pa, among nakita ang constitutively bound calmodulin (CaM) sa Iav ug AP-stabilized Nan pentamers. Kini nga mga resulta naghatag ug importanteng mga panabut sa regulasyon sa calcium ions sa mga channel, channel assembly, ug ang mga hinungdan nga nagtino sa ligand binding affinity. Mas importante, among gikumpirma nga ang ARD adunay sentral nga papel niini nga mga proseso. Ang among pagtuon sa kompleto nga mga channel sa insekto nga gibugkos sa may kalabutan nga mga pestisidyo sa agrikultura27, 28, 29nagbukas ug mga palaaboton alang sa pag-uswag sa industriya sa pestisidyo, pagpauswag sa kaepektibo ug espesipiko sa mga pestisidyo, ug pagpahimo sa paggamit sa mga compound nga gitarget sa TRPV sa ubang mga espisye aron matubag ang seguridad sa pagkaon sa kalibutan ug ang pagkaylap sa mga sakit nga dala sa vector.
Among nakita usab nga ang Nan-Iav gi-regulate sa Ca2+, ug ang mekanismo sa regulasyon gi-mediate sa constitutively bound CaM. Importante, kining Ca2+-dependent regulation sa Nav pinaagi sa CaM lahi kaayo sa mga mekanismo sa regulasyon sa ubang ion channels (pananglitan, voltage-gated Na+ channels ug TRPV5/6 channels)52,53,54,55,56,57Sa Nav1.2 channel, ang C-terminal domain sa CaM helical associate sa C-terminal domain (CTD), ug ang Ca2+ nag-induce sa pagbugkos sa N-terminal domain niini ngadto sa distal nga bahin sa CTD.56Sa TRPV5/6 channel, ang C-terminal domain sa CaM motapot sa CTH, ug ang Ca2+ moaghat sa paglugway pataas sa N-terminal domain niini ngadto sa pore, sa ingon niini babagan ang cation permeability.53,54. Nagsugyot kami og modelo para sa Ca2+-regulated function sa Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). Niini nga modelo, ang N-terminal domain sa CaM kanunay nga nagbugkos sa C-terminal domain (CTH) sa Iav. Sa resting state (ubos nga [Ca2+] concentration), ang C-terminal domain sa CaM nakig-interact sa Nan, nga nagpalig-on sa ARD conformation ug sa ingon nagpasiugda sa pag-abli sa channel. Ang pagbugkos sa usa ka agonist/insecticide sa channel nag-induce sa pag-abli sa pore, nga mosangpot sa Ca2+ influx. Ang Ca2+ unya nagbugkos sa CaM, nga hinungdan sa dissociation sa C-terminal domain gikan sa ARD sa Nan. Tungod kay ang pag-block sa CaM binding sa esensya nagwagtang sa inhibitory effect sa Ca2+, kini nga dissociation nag-modulate sa ARD mobility, sa ingon hinungdan sa Ca2+-dependent inhibition o desensitization. Ang paspas nga pagbawi sa channel currents human sa calcium ion elution (Fig. 4g) nagsugyot nga kini nga mekanismo nagpadali sa paspas nga mga tubag sa Ca2+-mediated neuronal signals. Dugang pa, ang C-terminal nga rehiyon sa Iav, nga wala pa kaayo masabti, gitaho nga adunay ubang mga papel sa pag-target sa channel ug kasamtangang regulasyon.21
Sa katapusan, ang among pagtuon nagpresentar sa taas nga resolusyon nga istruktura sa usa ka insecticide-insecticide TRP channel complex nga importante sa agrikultura—usa ka nadiskobrehan nga wala pa namo mahibal-i kaniadto. Talalupangdon nga among gihulagway ang istruktura ug gimbuhaton sa insect channel sa mga selula sa tawo (HEK293S GnTi–) imbes sa mga selula sa insekto. Atubangan sa nagkadako nga resistensya sa insecticide ug padayon nga presyur sa seguridad sa pagkaon ug mga pathogen, ang among trabaho naghatag ug hinungdanon nga impormasyon nga makapadali sa pag-uswag sa mga bag-ong insecticide alang sa kaayohan sa kahimsog sa tawo ug seguridad sa pagkaon sa kalibutan. Gipakita sa mga pagtuon nga ang mga insecticide sama sa AP epektibo batok sa pipila ka mga peste kung gamiton sumala sa mga instruksyon sa label ug adunay ubos nga acute toxicity sa mga mapuslanon nga pollinator, nga nagpakita sa ilang kaluwasan sa kalikopan.13,16Dugang pa, ang pagsulay sa pipila ka mga AP derivatives sa mga lamok nagpakita nga sa kadugayan mawad-an sila sa ilang abilidad sa paglupad. Ang pagsabot kung giunsa kini nga mga modulating compound nagbugkos sa Nan-Iav makapadali sa pag-usab sa mga naa na nga compound o pagpalambo sa mga bag-ong compound alang sa mas epektibo ugtukmapagkontrol sa peste. Gipakita sa among pagtuon nga ang Nan-Iav ARD interface importante dili lamang sa pag-regulate sa kalihokan sa mga endogenous compound, pestisidyo, ug Ca2+-CaM, apan alang usab sa pag-assemble sa channel. Gisugyot namo nga ang pag-disrupt sa heterodimer assembly gamit ang gagmay nga mga molekula mahimong usa ka talagsaon ug maayong pamaagi alang sa pagpalambo sa mga ion channel inhibitor.
Sa walo ka orthologous genes, ang full-length genes sa brown beetle (Halyomorpha halys) nga Nanchung ug Inactive ang napili, nga nagpakita sa maayo kaayong kalig-on sa mga detergent. Ang na-synthesize nga mga gene gi-codon-optimize para sa human expression ug gi-clone sa pBacMam pCMV-DEST vector (Life Technologies) gamit ang XhoI ug EcoRI restriction sites. Kini nagsiguro nga ang mga clone naa sa frame uban sa C-terminal GFP-FLAG-10xHis ug mCherry-FLAG-10xHis tags, nga gi-cleave sa HRC-3C protease (PPX), nga nagtugot sa independente nga pag-convert sa mga gene ngadto sa lain-laing mga gene.ekspresyonAng mga primer nga gigamit sa pag-clone sa Nanchung ug Inactive ngadto sa pBacMam vector mao ang mosunod:
Ang mga mikroskopikong imahe sa indibidwal nga mga partikulo nakuha gamit ang usa ka Titan Krios G2 transmission electron microscope (FEI) nga adunay K3 camera ug usa ka Gatan BioQuantum energy filter. Ang mikroskopyo gipadagan sa 300 keV, nga adunay energy setting nga 20 eV, usa ka sample pixel size nga 1.08 Å/pixel (nominal magnification nga 81,000x), ug usa ka defocus gradient gikan sa -0.8 hangtod -2.2 μm. Ang pagrekord sa video gihimo sa 40 frames kada segundo gamit ang Latitude S microscope (Gatan) nga adunay nominal dose rate nga 25 e–px−1 s−1, usa ka exposure time nga 2.4 s, ug usa ka total nga dosis nga gibana-bana nga 60 e–Å−2.
Ang beam-induced motion correction ug dose weighting gihimo sa film gamit ang MotionCor2 sa RELION 4.061. Ang contrast transfer function (CTF) parameter estimation gihimo sa cryoSPARC gamit ang patch-based CTF estimation method62. Ang mga photomicrograph nga adunay CTF fitting resolution ≥4 Å wala gilakip sa sunod nga pag-analisa. Kasagaran, usa ka subset nga 500–1000 ka photomicrograph ang gigamit para sa point selection sa cryoSPARC, gisundan sa pipila ka rounds sa 2D classification human sa filtering aron makakuha og klaro nga reference image para sa template-based particle selection. Ang mga particle gi-extract dayon gamit ang 64-pixel bounding boxes ug 4-fold binning. Daghang rounds sa 2D classification ang gihimo aron makuha ang dili gusto nga mga particle categories. Ang inisyal nga 3D model gi-reconstruct gamit ang ab initio reconstruction ug gi-refine gamit ang nonuniform refinement sa cryoSPARC. Ang 3D classification gihimo sa cryoSPARC o RELION base sa ARD heterogeneity. Walay nakitang significant heterogeneity sa membrane domains. Ang mga partikulo gipino gamit ang mga pamaagi sa C1 ug C2; ang mga partikulo nga adunay mas taas nga resolusyon sa C2 giisip nga simetriko kalabot sa C2 ug gi-import sa RELION alang sa Bayesian refinement. Ang mga partikulo gibalhin dayon balik sa cryoSPARC alang sa katapusang dili parehas ug lokal nga refinement. Ang katapusang resolusyon ug ihap sa partikulo gipakita sa Talaan 1.
Sa pagproseso sa mga Nan+AP pentamer, among gisusi ang lain-laing mga pamaagi aron mapaayo ang resolusyon sa mga membrane domain (ilabi na ang pore region), sama sa signal subtraction ug TMD masking. Bisan pa, kini nga mga pagsulay wala molampos tungod sa posibleng grabeng disorder sa pore region ug sa kinatibuk-ang heterogeneity sa TMD. Ang katapusang resolusyon gikalkulo gamit ang usa ka mask nga awtomatikong namugna sa nonuniform processing method sa cryoSPARC, nga panguna nga nagtumong sa ARD region. Kini nakab-ot ang mas taas nga resolusyon kaysa sa mga membrane domain (ilabi na ang VSLD region).
Ang inisyal nga de novo nga mga modelo sa apo nga mga porma sa Nanchung ug Inactive nga mga bug unang gihimo gamit ang Coot63, ug ang mga modelo sa Nan ug Iav nga mga bug gihimo gamit ang AlphaFold264 aron mailhan ang mga low-confidence nga rehiyon. Ang pagmodelo sa Calmodulin gibase sa rigid-body fit sa Ca2+-binding ug Ca2+-free nga mga modelo sa PDB accessions 4JPZ56 ug 1CFD65, matag usa. Ang mga modelo gipino gamit ang spherical refinement aron masiguro ang husto nga stereochemistry ug maayong geometry. Ang Phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, ug phosphatidylserine gimodelo dayon isip maayo nga gihubit nga lipid densities, ug ang NAM ug AP ligands gibutang sa katugbang nga densities sa tight junctions. Ang mga constraint file gihimo gikan sa SMILES string sa mga isoform gamit ang eLBOW sa PHENIX66. Sa katapusan, ang mga modelo gipino sa tinuod nga wanang sa PHENIX gamit ang local grid search ug global minimization nga adunay secondary structure constraints. Ang MolProbity server gigamit para sa pagpino sa modelo ug pag-analisar sa istruktura, ug ang mga ilustrasyon gihimo gamit ang PyMOL ug UCSF Chimera X. 67,68,69 Ang pag-analisar sa aperture gihimo gamit ang HOLE server,70 ug ang pagmapa sa konserbasyon sa sequence gihimo gamit ang Consurf server.71
Ang estadistikal nga pag-analisa gihimo gamit ang Igor Pro 6.2, Excel Office 365, ug GraphPad Prism 7.0. Ang tanang quantitative data gipresentar isip mean ± standard error (SEM). Ang Student's t-test (two-tailed, unpaired) gigamit sa pagtandi sa duha ka grupo. Ang One-way analysis of variance (ANOVA) gisundan sa Dunnett's post hoc test gigamit sa pagtandi sa daghang grupo. *P< 0.05, **P< 0.01, ug ***PAng < 0.001 giisip nga statistically significant depende sa data distribution. Ang Kd, Ki values, ug ang ilang asymmetric 95% confidence intervals gikalkulo gamit ang GraphPad Prism 10.
Alang sa dugang detalye sa metodolohiya sa pagtuon, palihug tan-awa ang Nature Portfolio Report Summary nga nalambigit niini nga artikulo.
Ang inisyal nga modelo gitukod gamit ang mga calmodulin model gikan sa PDB 4JPZ ug 1CFD databases. Ang mga coordinate gibutang sa Protein Data Bank (PDB) ubos sa accession numbers nga 9NVN (Nan-Iav-CaM nga walay ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM nga nakagapos sa nicotinamide), 9NVP (Nan-Iav-CaM nga nakagapos sa nicotinamide ug EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM nga nakagapos sa aphenidolpyrrolline ug calcium), 9NVR (Nan-Iav-CaM nga nakagapos sa aphenidolpyrrolline ug EDTA), ug 9NVS (Nan pentamer nga nakagapos sa aphenidolpyrrolline). Ang katugbang nga mga imahe sa cryo-electron microscopy gibutang sa Electron Microscopy Database (EMDB) ubos sa mosunod nga mga numero sa accession: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM nga walay ligand), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM complex nga adunay nicotinamide), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM complex nga adunay nicotinamide ug EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM complex nga adunay aphidopyrrolline ug calcium), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM complex nga adunay aphidopyrrolline ug EDTA), ug EMD-49849 (Nan pentamer complex nga adunay aphidopyrrolline). Ang hilaw nga datos alang sa functional analysis gipresentar niini nga papel.
Oras sa pag-post: Enero 28, 2026