Ang tambal nga anthelmintic nga N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) gikataho nga makapugong sa AChE (acetylcholinesterase) ug adunay potensyal nga makakanser nga mga kabtangan tungod sa sobra nga vascularization. Niini nga papel, gipakita namon nga ang DEET espesipikong nagdasig sa mga endothelial cells nga nagpasiugda sa angiogenesis, sa ingon nagdugang ang pagtubo sa tumor. Gi-aktibo sa DEET ang mga proseso sa cellular nga nagdala sa angiogenesis, lakip ang pagdaghan, paglalin, ug pagdikit. Nalambigit kini sa dugang nga produksiyon sa NO ug ekspresyon sa VEGF sa mga endothelial cells. Ang pagpahilom sa M3 o paggamit sa pharmacological M3 inhibitors nagwagtang sa tanan niini nga mga epekto, nga nagsugyot nga angiogenesis nga gipahinabo sa DEET kay sensitibo sa M3. Ang mga eksperimento nga naglambigit sa calcium signaling sa endothelial ug HEK nga mga selula nga nag-overexpress sa M3 nga mga receptor, ingon man ang pagbugkos ug pag-docking nga mga pagtuon, nagpakita nga ang DEET naglihok isip allosteric modulator sa M3 receptors. Dugang pa, gipugngan sa DEET ang AChE, sa ingon nagdugang ang bioavailability sa acetylcholine ug ang pagbugkos niini sa mga receptor sa M3, ug gipauswag ang mga epekto sa proangiogenic pinaagi sa allosteric regulation.
Ang mga nag-unang EC gilain gikan sa aorta sa mga ilaga sa Switzerland. Ang pamaagi sa pagkuha gipahaom gikan sa Kobayashi protocol 26 . Ang mga Murine EC gi-culture sa EBM-2 medium nga gidugangan sa 5% nga heat-inactivated nga FBS hangtod sa ikaupat nga tudling.
Ang epekto sa duha ka konsentrasyon sa DEET sa pagdaghan sa HUVEC, U87MG, o BF16F10 gisusi gamit ang CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Sa makadiyot, 5.103 ka mga selula matag atabay ang gisabod sa usa ka 96 ka atabay nga plato, gitugotan nga makatapot sa tibuok gabii, ug dayon gitambalan sa DEET sulod sa 24 ka oras. Human makuha ang growth medium, idugang ang dye binding solution sa matag atabay sa microplate ug i-incubate ang mga cell sa 37 °C sulod sa 30 min. Ang lebel sa fluorescence gitino gamit ang Mithras LB940 multimode microplate reader (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) nga adunay 485 nm excitation filters ug 530 nm emission filters.
Ang HUVEC gisabod sa 96 ka atabay nga mga plato sa densidad nga 104 ka mga selula kada atabay. Ang mga selula gitambalan sa DEET sulod sa 24 ka oras. Ang cell viability gisusi gamit ang colorimetric MTT assay (Sigma-Aldrich, M5655). Ang mga kantidad sa optical density nakuha sa usa ka multimode microplate reader (Mithras LB940) sa usa ka wavelength nga 570 nm.
Ang mga epekto sa DEET gitun-an gamit ang in vitro angiogenesis assays. Ang pagtambal nga adunay 10-8 M o 10-5 M DEET nagdugang sa pagporma sa gitas-on sa capillary sa HUVECs (Fig. 1a, b, puti nga mga bar). Kung itandi sa kontrol nga grupo, ang pagtambal nga adunay mga konsentrasyon sa DEET gikan sa 10-14 hangtod 10-5 M nagpakita nga ang gitas-on sa capillary nakaabot sa usa ka talampas sa 10-8 M DEET (Supplementary Fig. S2). Wala’y nakita nga hinungdanon nga kalainan sa in vitro proangiogenic nga epekto sa HUVEC nga gitambalan sa DEET sa sakup sa konsentrasyon nga 10-8 M ug 10-5 M.
Aron mahibal-an ang epekto sa DEET sa neovascularization, gihimo namon ang mga pagtuon sa vivo neovascularization. Human sa 14 ka adlaw, ang mga ilaga nga gi-injected sa endothelial cells nga precultured sa 10-8 M o 10-5 M DEET nagpakita ug dakong pagtaas sa hemoglobin content (Fig. 1c, white bars).
Dugang pa, ang DEET-induced neovascularization gitun-an sa U87MG xenograft-bearing nga mga ilaga nga gi-injected kada adlaw (ip) nga adunay DEET sa usa ka dosis nga nahibal-an nga mag-aghat sa mga konsentrasyon sa plasma nga 10-5 M, nga normal sa nabutyag nga mga tawo. sa 23. Mamatikdan nga mga tumor (ie mga tumor> 100 mm3) naobserbahan 14 ka adlaw human sa pag-inject sa U87MG nga mga selula ngadto sa mga ilaga. Sa adlaw nga 28, ang pagtubo sa tumor labi nga gipauswag sa mga ilaga nga gitambalan sa DEET kumpara sa kontrol nga mga ilaga (Fig. 1d, mga kwadro). Dugang pa, ang pagmantsa sa CD31 sa mga tumor nagpakita nga ang DEET dako nga pagtaas sa capillary area apan dili microvessel density. (Fig. 1e–g).
Aron mahibal-an ang papel sa muscarinic receptors sa DETA-induced proliferation, ang 10-8 M o 10-5 M DETA sa presensya sa pFHHSiD (10-7 M, usa ka pinili nga M3 receptor antagonist) gigamit. Pagtambal sa HUVEC. Ang pFHHSiD hingpit nga gibabagan ang proliferative properties sa DETA sa tanang konsentrasyon (Table 1).
Ubos niini nga mga kondisyon, gisusi usab namo kung ang DEET makadugang sa gitas-on sa capillary sa mga selula sa HUVEC. Sa susama, ang pFHHSiD mahinungdanon nga nakapugong sa DEET-induced capillary length (Fig. 1a, b, gray nga mga bar). Dugang pa, ang susama nga mga eksperimento gihimo sa M3 siRNA. Bisan tuod ang kontrol nga siRNA dili epektibo sa pagpasiugda sa pagporma sa capillary, ang pagpahilom sa M3 muscarinic receptor nagwagtang sa abilidad sa DEET sa pagdugang sa gitas-on sa capillary (Fig. 1a, b, itom nga mga bar).
Dugang pa, ang 10-8 M o 10-5 M DEET-induced vascularization in vitro ug neovascularization in vivo hingpit nga gibabagan sa pFHHSiD (Fig. 1c, d, circles). Kini nga mga resulta nagpakita nga ang DEET nagpasiugda sa angiogenesis pinaagi sa usa ka agianan nga sensitibo sa pinili nga M3 receptor antagonists o M3 siRNA.
Ang AChE mao ang molekular nga target sa DEET. Ang mga tambal sama sa donepezil, nga naglihok isip AChE inhibitors, makapukaw sa EC angiogenesis in vitro ug sa mouse hindlimb ischemia models14. Among gisulayan ang epekto sa duha ka konsentrasyon sa DEET sa AChE enzyme activity sa HUVEC. Ubos (10-8 M) ug taas (10-5 M) nga konsentrasyon sa DEET mikunhod ang endothelial AChE nga kalihokan kumpara sa pagkontrol sa mga kondisyon (Fig. 2).
Ang duha ka konsentrasyon sa DEET (10-8 M ug 10-5 M) mikunhod sa acetylcholinesterase nga kalihokan sa HUVEC. Ang BW284c51 (10-5 M) gigamit isip kontrol sa acetylcholinesterase inhibitors. Ang mga resulta gipahayag isip porsyento sa kalihokan sa AChE sa HUVEC nga gitambalan sa duha ka konsentrasyon sa DEET kumpara sa mga selula nga gitambalan sa sakyanan. Ang mga kantidad gipahayag ingon mean ± SEM sa unom nga independente nga mga eksperimento. * p <0.05 kumpara sa kontrol (Kruskal-Wallis ug Dunn daghang pagsulay sa pagtandi).
Ang nitric oxide (NO) nalangkit sa proseso sa angiogenic 33, busa, WALAY produksyon sa DEET-stimulated HUVECs ang gitun-an. Ang DEET-treated endothelial NO nga produksiyon nadugangan kumpara sa pagkontrol sa mga selula, apan nakab-ot ang kahulogan lamang sa usa ka dosis nga 10-8 M (Fig. 3c). Aron mahibal-an ang mga pagbag-o sa molekula nga nagkontrol sa DEET-induced NO nga produksiyon, ang ekspresyon ug pagpaaktibo sa eNOS gisusi sa Western blotting. Bisan kung ang pagtambal sa DEET wala magbag-o sa ekspresyon sa eNOS, kini labi nga nagpataas sa eNOS phosphorylation sa activating site niini (Ser-1177) samtang gikunhuran ang inhibitory site niini (Thr-495) kumpara sa wala matambalan nga mga selula sa eNOS phosphorylation (Fig. 3d). Dugang pa, ang ratio sa phosphorylated eNOS sa activation site ug inhibitory site gikalkulo human sa pag-normalize sa gidaghanon sa phosphorylated eNOS sa kinatibuk-ang gidaghanon sa enzyme. Kini nga ratio dako nga pagtaas sa HUVECs nga gitambalan sa matag konsentrasyon sa DEET kon itandi sa wala matambalan nga mga selula (Fig. 3d).
Sa katapusan, ang ekspresyon sa VEGF, usa sa mga nag-unang proangiogenic nga mga hinungdan, gisusi sa Western blotting. Ang DEET labi nga nagdugang sa ekspresyon sa VEGF, samtang ang pFHHSiD hingpit nga gibabagan kini nga ekspresyon.
Tungod kay ang mga epekto sa DEET sensitibo sa pharmacological blockade ug downregulation sa M3 receptors, among gisulayan ang hypothesis nga ang DEET mahimong makapauswag sa calcium signaling. Katingad-an, ang DEET napakyas sa pagdugang sa cytoplasmic calcium sa HUVEC (data nga wala gipakita) ug HEK / M3 (Fig. 4a, b) alang sa duha ka konsentrasyon nga gigamit.
Oras sa pag-post: Dis-30-2024