Ang tambal nga anthelmintic nga N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) gitaho nga nagpugong sa AChE (acetylcholinesterase) ug adunay potensyal nga carcinogenic properties tungod sa sobra nga vascularization. Niini nga papel, among gipakita nga ang DEET espesipikong nagdasig sa mga endothelial cells nga nagpasiugda sa angiogenesis, sa ingon nagdugang sa pagtubo sa tumor. Ang DEET nag-activate sa mga proseso sa cellular nga mosangpot sa angiogenesis, lakip ang pagdaghan, pagbalhin, ug adhesion. Kini nalangkit sa dugang nga produksiyon sa NO ug ekspresyon sa VEGF sa mga endothelial cells. Ang pagpahilom sa M3 o paggamit sa pharmacological M3 inhibitors nagwagtang niining tanan nga mga epekto, nga nagsugyot nga ang DEET-induced angiogenesis sensitibo sa M3. Ang mga eksperimento nga naglambigit sa calcium signaling sa mga endothelial ug HEK cells nga nag-overexpress sa mga M3 receptor, ingon man mga pagtuon sa pagbugkos ug pag-docking, nagpakita nga ang DEET naglihok isip usa ka allosteric modulator sa mga M3 receptor. Dugang pa, ang DEET nagpugong sa AChE, sa ingon nagdugang sa bioavailability sa acetylcholine ug sa pagbugkos niini sa mga M3 receptor, ug nagpalambo sa mga proangiogenic nga epekto pinaagi sa allosteric regulation.
Ang mga primary EC gi-isolate gikan sa aorta sa mga Swiss mice. Ang pamaagi sa pagkuha gi-adapt gikan sa Kobayashi protocol 26. Ang mga Murine EC gi-culture sa EBM-2 medium nga gisuplayan og 5% heat-inactivated FBS hangtod sa ikaupat nga passage.
Ang epekto sa duha ka konsentrasyon sa DEET sa pagdaghan sa HUVEC, U87MG, o BF16F10 gisusi gamit ang CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Sa laktod nga pagkasulti, 5.103 ka mga selula matag atabay ang gipugas sa usa ka 96-well plate, gitugotan nga motapot sa tibuok gabii, ug dayon gitambalan og DEET sulod sa 24 oras. Human makuha ang growth medium, idugang ang dye binding solution sa matag atabay sa microplate ug i-incubate ang mga selula sa 37 °C sulod sa 30 minutos. Ang lebel sa fluorescence gitino gamit ang Mithras LB940 multimode microplate reader (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) nga adunay 485 nm excitation filters ug 530 nm emission filters.
Ang mga HUVEC gipugas sa 96-well plates sa density nga 104 ka cells kada well. Ang mga cells gitambalan og DEET sulod sa 24 oras. Ang cell viability gisusi gamit ang colorimetric MTT assay (Sigma-Aldrich, M5655). Ang optical density values nakuha sa usa ka multimode microplate reader (Mithras LB940) sa wavelength nga 570 nm.
Ang mga epekto sa DEET gitun-an gamit ang in vitro angiogenesis assays. Ang pagtambal gamit ang 10-8 M o 10-5 M DEET nagdugang sa pagporma sa capillary length sa mga HUVEC (Fig. 1a, b, white bars). Kung itandi sa control group, ang pagtambal gamit ang DEET concentrations gikan sa 10-14 hangtod 10-5 M nagpakita nga ang capillary length nakaabot sa plateau sa 10-8 M DEET (Supplementary Fig. S2). Walay nakitang dakong kalainan sa in vitro proangiogenic effect sa mga HUVEC nga gitambalan og DEET sa concentration range nga 10-8 M ug 10-5 M.
Aron mahibal-an ang epekto sa DEET sa neovascularization, naghimo kami og in vivo neovascularization studies. Human sa 14 ka adlaw, ang mga ilaga nga gi-injectan og endothelial cells nga gi-preculture og 10-8 M o 10-5 M DEET nagpakita og dakong pagtaas sa hemoglobin content (Fig. 1c, white bars).
Dugang pa, ang DEET-induced neovascularization gitun-an sa mga ilaga nga adunay U87MG xenograft nga gi-inject kada adlaw (ip) og DEET sa dosis nga nahibal-an nga maka-induce sa plasma concentrations nga 10-5 M, nga normal sa mga tawo nga na-expose. sa 23. Ang makit-an nga mga tumor (ie mga tumor >100 mm3) naobserbahan 14 ka adlaw human sa pag-inject sa mga U87MG cells ngadto sa mga ilaga. Sa ika-28 nga adlaw, ang pagtubo sa tumor miusbaw pag-ayo sa mga ilaga nga gitambalan og DEET kon itandi sa mga control mice (Fig. 1d, squares). Dugang pa, ang CD31 staining sa mga tumor nagpakita nga ang DEET miusbaw pag-ayo sa capillary area apan dili sa microvessel density. (Fig. 1e–g).
Aron mahibal-an ang papel sa mga muscarinic receptor sa pagdaghan sa DETA, gigamit ang 10-8 M o 10-5 M DETA sa presensya sa pFHHSiD (10-7 M, usa ka selective M3 receptor antagonist). Pagtambal sa HUVEC. Ang pFHHSiD hingpit nga nakababag sa mga proliferative properties sa DETA sa tanang konsentrasyon (Talaan 1).
Ubos niini nga mga kondisyon, among gisusi usab kung ang DEET makadugang ba sa gitas-on sa capillary sa mga selula sa HUVEC. Sa susama, ang pFHHSiD nakapugong pag-ayo sa gitas-on sa capillary nga gipahinabo sa DEET (Fig. 1a, b, gray bars). Dugang pa, parehas nga mga eksperimento ang gihimo gamit ang M3 siRNA. Bisan kung ang control siRNA dili epektibo sa pagpasiugda sa pagporma sa capillary, ang pagpahilom sa M3 muscarinic receptor nagwagtang sa abilidad sa DEET sa pagdugang sa gitas-on sa capillary (Fig. 1a, b, black bars).
Dugang pa, ang 10-8 M o 10-5 M DEET-induced vascularization in vitro ug neovascularization in vivo hingpit nga gibabagan sa pFHHSiD (Fig. 1c, d, circles). Kini nga mga resulta nagpakita nga ang DEET nagpasiugda sa angiogenesis pinaagi sa usa ka pathway nga sensitibo sa selective M3 receptor antagonists o M3 siRNA.
Ang AChE mao ang molekular nga target sa DEET. Ang mga tambal sama sa donepezil, nga molihok isip AChE inhibitors, makapadasig sa EC angiogenesis in vitro ug sa mga modelo sa ischemia sa hindlimb sa ilaga14. Gisulayan namo ang epekto sa duha ka konsentrasyon sa DEET sa kalihokan sa enzyme sa AChE sa HUVEC. Ang ubos (10-8 M) ug taas (10-5 M) nga konsentrasyon sa DEET mikunhod sa kalihokan sa endothelial AChE kon itandi sa mga kondisyon sa kontrol (Fig. 2).
Ang duha ka konsentrasyon sa DEET (10-8 M ug 10-5 M) nakapakunhod sa kalihokan sa acetylcholinesterase sa HUVEC. Ang BW284c51 (10-5 M) gigamit isip kontrol para sa mga acetylcholinesterase inhibitor. Ang mga resulta gipahayag isip porsyento sa kalihokan sa AChE sa HUVEC nga gitambalan sa duha ka konsentrasyon sa DEET kon itandi sa mga selula nga gitambalan sa sakyanan. Ang mga kantidad gipahayag isip mean ± SEM sa unom ka independente nga mga eksperimento. *p < 0.05 kon itandi sa kontrol (Kruskal-Wallis ug Dunn multiple comparison test).
Ang nitric oxide (NO) nalambigit sa angiogenic process 33, busa, gitun-an ang produksiyon sa NO sa mga DEET-stimulated HUVEC. Ang produksiyon sa endothelial NO nga gitambalan sa DEET misaka kon itandi sa mga control cell, apan nakaabot sa significance sa dosis nga 10-8 M lamang (Fig. 3c). Aron mahibal-an ang mga pagbag-o sa molekula nga nagkontrol sa produksiyon sa NO nga gipahinabo sa DEET, ang ekspresyon ug pagpaaktibo sa eNOS gisusi pinaagi sa Western blotting. Bisan kung ang pagtambal sa DEET wala makausab sa ekspresyon sa eNOS, kini midugang pag-ayo sa phosphorylation sa eNOS sa activating site niini (Ser-1177) samtang mikunhod ang inhibitory site niini (Thr-495) kon itandi sa wala matambali nga mga selula sa eNOS phosphorylation (Fig. 3d). Dugang pa, ang ratio sa phosphorylated eNOS sa activation site ug inhibitory site gikalkulo human sa pag-normalize sa gidaghanon sa phosphorylated eNOS sa kinatibuk-ang gidaghanon sa enzyme. Kini nga ratio miusbaw pag-ayo sa mga HUVEC nga gitambalan sa matag konsentrasyon sa DEET kon itandi sa wala matambali nga mga selula (Fig. 3d).
Sa katapusan, ang ekspresyon sa VEGF, usa sa mga nag-unang proangiogenic nga hinungdan, gisusi pinaagi sa Western blotting. Ang DEET midugang pag-ayo sa ekspresyon sa VEGF, samtang ang pFHHSiD hingpit nga nagbabag niini nga ekspresyon.
Tungod kay ang mga epekto sa DEET sensitibo sa pharmacological blockade ug downregulation sa M3 receptors, among gisulayan ang hypothesis nga ang DEET mahimong mopausbaw sa calcium signaling. Katingad-an, ang DEET napakyas sa pagdugang sa cytoplasmic calcium sa HUVEC (wala gipakita ang datos) ug HEK/M3 (Fig. 4a, b) para sa duha ka konsentrasyon nga gigamit.
Oras sa pag-post: Disyembre 30, 2024