Gipadayag sa Quantitative Gibberellin Biosensor ang Papel sa Gibberellins sa Internode Specification sa Shoot Apical Meristem

Ang pagpatubo sa apical meristem (SAM) hinungdanon alang sa arkitektura sa tukog. Mga hormone sa tanumgibberellin(GAs) adunay mahinungdanong mga tahas sa pag-coordinate sa pagtubo sa tanum, apan ang ilang papel sa SAM nagpabilin nga dili kaayo masabtan. Dinhi, naghimo kami usa ka ratiometric biosensor sa pagsenyas sa GA pinaagi sa pag-engineer sa protina sa DELLA aron pugngan ang hinungdanon nga function sa regulasyon sa tubag sa transkripsyon sa GA samtang gipreserbar ang pagkadaot niini sa pag-ila sa GA. Gipakita namon nga kini nga biosensor nga nakabase sa degradasyon tukma nga nagrekord sa mga pagbag-o sa lebel sa GA ug cellular sensing sa panahon sa pag-uswag. Gigamit namo kini nga biosensor sa pagmapa sa kalihokan sa pagsenyas sa GA sa SAM. Gipakita namon nga ang taas nga mga signal sa GA naa sa kadaghanan sa mga selyula nga nahimutang taliwala sa organ primordia, nga mga pasiuna sa mga internode nga mga selula. Pinaagi sa paggamit sa gain- ug loss-of-function approaches, dugang nga gipakita namo nga ang GA nag-regulate sa oryentasyon sa cell division plane, nga nagtukod sa canonical cellular nga organisasyon sa mga internodes, sa ingon nagpasiugda sa internode specification sa SAM.
Ang shoot apical meristem (SAM), nga nahimutang sa shoot apex, adunay niche sa mga stem cell kansang kalihokan nagpatunghag lateral organs ug stem nodes sa modular ug iterative nga paagi sa tibuok kinabuhi sa tanom. Ang matag usa niining nagbalikbalik nga mga yunit, o mga buko sa tanom, naglakip sa mga internode ug lateral nga mga organo sa mga buko, ug mga axillary meristem sa mga axils sa dahon1. Ang pagtubo ug organisasyon sa mga buko sa tanum nausab sa panahon sa pag-uswag. Sa Arabidopsis, ang internodal nga pagtubo gipugngan sa panahon sa vegetative nga yugto, ug ang axillary meristems nagpabilin nga dormant sa mga axils sa mga dahon sa rosette. Atol sa transisyon ngadto sa floral phase, ang SAM nahimong inflorescence meristem, nga nagpatunghag elongated internodes ug axillary buds, branchlets sa axils sa cauline dahon, ug sa ulahi, walay dahon nga mga bulak2. Bisan tuod nakahimo kami og mahinungdanon nga pag-uswag sa pagsabut sa mga mekanismo nga nagkontrol sa pagsugod sa mga dahon, mga bulak, ug mga sanga, medyo gamay ang nahibal-an kon sa unsang paagi mitungha ang mga internode.
Ang pagsabut sa spatiotemporal nga pag-apod-apod sa mga GA makatabang aron mas masabtan ang mga gimbuhaton niini nga mga hormone sa lainlaing mga tisyu ug sa lainlaing mga yugto sa pag-uswag. Ang pagtan-aw sa pagkadaut sa RGA-GFP fusion nga gipahayag ubos sa aksyon sa kaugalingon nga tigpasiugda naghatag og importante nga kasayuran sa regulasyon sa kinatibuk-ang lebel sa GA sa mga ugat15,16. Bisan pa, ang ekspresyon sa RGA magkalainlain sa mga tisyu17 ug gi-regulate sa GA18. Busa, ang pagpahayag sa kalainan sa tigpasiugda sa RGA mahimong moresulta sa pattern sa fluorescence nga naobserbahan sa RGA-GFP ug sa ingon kini nga pamaagi dili quantitative. Bag-ohay lang, ang bioactive fluorescein (Fl)-label nga GA19,20 nagpadayag sa pagtipon sa GA sa root endocortex ug ang regulasyon sa lebel sa cellular niini pinaagi sa GA transport. Bag-ohay lang, ang GA FRET sensor nlsGPS1 nagpakita nga ang mga lebel sa GA adunay kalabotan sa pagpalapad sa cell sa mga ugat, filament, ug itom nga pagtubo nga hypocotyls21. Bisan pa, sama sa among nakita, ang konsentrasyon sa GA dili lamang ang parameter nga nagkontrol sa kalihokan sa pagsenyas sa GA, tungod kay nagdepende kini sa mga komplikado nga proseso sa pag-sensing. Dinhi, nga nagtukod sa among pagsabot sa DELLA ug GA nga mga agianan sa pagsenyas, among gitaho ang pag-uswag ug pagkilala sa usa ka ratiometric biosensor nga nakabase sa degradasyon alang sa pagsenyas sa GA. Aron mapalambo kini nga quantitative biosensor, gigamit namon ang usa ka mutant nga GA-sensitive nga RGA nga gisagol sa usa ka fluorescent nga protina ug ubiquitously gipahayag sa mga tisyu, ingon man usa ka GA-insensitive fluorescent nga protina. Gipakita namon nga ang mutant RGA protein fusions dili makabalda sa endogenous GA signaling kung gipahayag sa tanan, ug nga kini nga biosensor mahimong ma-quantify ang kalihokan sa pagsenyas nga resulta sa parehas nga input sa GA ug pagproseso sa signal sa GA pinaagi sa sensing apparatus nga adunay taas nga resolusyon sa spatiotemporal. Gigamit namon kini nga biosensor aron mapa ang spatiotemporal nga pag-apod-apod sa kalihokan sa pagsenyas sa GA ug pag-ihap kung giunsa ang pag-regulate sa GA sa cellular nga pamatasan sa SAM epidermis. Gipakita namo nga ang GA nag-regulate sa oryentasyon sa division plane sa SAM cells nga nahimutang sa taliwala sa organ primordia, sa ingon nagpaila sa canonical cellular nga organisasyon sa internode.
Sa katapusan, nangutana kami kung ang qmRGA maka-report sa mga pagbag-o sa endogenous nga lebel sa GA gamit ang nagtubo nga hypocotyl. Gipakita namon kaniadto nga ang nitrate nagdasig sa pagtubo pinaagi sa pagdugang sa GA synthesis ug, sa baylo, ang pagkadaot sa DELLA34. Subay niini, among naobserbahan nga ang hypocotyl nga gitas-on sa pUBQ10::qmRGA nga mga seedling nga gipatubo ubos sa abunda nga nitrate nga suplay (10 mM NO3−) mas taas kay sa mga seedling nga gipatubo ubos sa nitrate-deficient nga kondisyon (Supplementary Fig. 6a). Nahiuyon sa tubag sa pagtubo, ang mga signal sa GA mas taas sa hypocotyl sa mga seedling nga gipatubo ubos sa 10 mM NO3− nga mga kondisyon kaysa sa mga seedling nga mitubo nga walay nitrate (Supplementary Fig. 6b, c). Sa ingon, ang qmRGA nagtugot usab sa pag-monitor sa mga pagbag-o sa pagsenyas sa GA nga gipahinabo sa mga endogenous nga pagbag-o sa konsentrasyon sa GA.
Aron masabtan kung ang kalihokan sa pagsenyas sa GA nga nakit-an sa qmRGA nagdepende sa konsentrasyon sa GA ug panglantaw sa GA, sama sa gipaabot base sa disenyo sa sensor, among gisusi ang ekspresyon sa tulo ka GID1 nga mga receptor sa vegetative ug reproductive tissues. Sa mga seedling, ang GID1-GUS reporter line nagpakita nga ang GID1a ug c gipahayag pag-ayo sa mga cotyledon (Fig. 3a-c). Dugang pa, ang tanan nga tulo ka mga receptor gipahayag sa mga dahon, lateral root primordia, mga tip sa gamut (gawas sa root cap sa GID1b), ug ang vascular system (Fig. 3a-c). Sa inflorescence SAM, nakit-an namon ang mga signal sa GUS alang lamang sa GID1b ug 1c (Supplementary Fig. 7a-c). Ang in situ hybridization nagpamatuod niini nga mga pattern sa ekspresyon ug dugang nga gipakita nga ang GID1c parehas nga gipahayag sa ubos nga lebel sa SAM, samtang ang GID1b nagpakita sa mas taas nga ekspresyon sa periphery sa SAM (Supplementary Fig. 7d-l). Ang pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b translational fusion nagpadayag usab sa usa ka graded range sa GID1b nga ekspresyon, gikan sa ubos o walay ekspresyon sa sentro sa SAM ngadto sa taas nga ekspresyon sa mga utlanan sa organ (Supplementary Fig. 7m). Sa ingon, ang GID1 nga mga receptor dili parehas nga giapod-apod sa tibuuk ug sulod sa mga tisyu. Sa misunod nga mga eksperimento, namatikdan usab namo nga ang sobrang pagpahayag sa GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) nagdugang sa pagkasensitibo sa qmRGA sa hypocotyls ngadto sa eksternal nga aplikasyon sa GA (Fig. 3d, e). Sa kasukwahi, ang fluorescence nga gisukod sa qd17mRGA sa hypocotyl dili sensitibo sa GA3 nga pagtambal (Fig. 3f, g). Para sa duha ka assays, ang mga seedling gitambalan nga adunay taas nga konsentrasyon sa GA (100 μM GA3) aron masusi ang paspas nga kinaiya sa sensor, diin ang abilidad sa pagbugkos sa GID1 receptor gipadako o nawala. Mag-uban, kini nga mga resulta nagpamatuod nga ang qmRGA biosensor nag-alagad sa usa ka hiniusa nga function ingon nga usa ka GA ug GA sensor, ug nagsugyot nga ang differential expression sa GID1 receptor mahimo kamahinungdanon modulate sa emissivity sa sensor.
Hangtod karon, ang pag-apod-apod sa mga signal sa GA sa SAM nagpabilin nga dili klaro. Busa, gigamit namo ang qmRGA-expressing plants ug ang pCLV3 :: mCherry-NLS stem cell reporter35 aron kuwentahon ang high-resolution quantitative nga mga mapa sa GA signaling activity, nga nagtutok sa L1 layer (epidermis; Fig. 4a, b, tan-awa ang Methods and Supplementary Methods), tungod kay ang L1 adunay importante nga papel sa pagkontrol sa SAM nga pagtubo36. Dinhi, ang pCLV3 :: mCherry-NLS nga ekspresyon naghatag ug fixed geometric reference point para sa pag-analisar sa spatiotemporal distribution sa GA signaling activity37. Bisan tuod ang GA giisip nga kinahanglanon alang sa lateral organ development4, among naobserbahan nga ang GA signal ubos sa floral primordium (P) sugod sa P3 stage (Fig. 4a, b), samtang ang mga batan-ong P1 ug P2 primordiums adunay kasarangang kalihokan nga susama nianang sa central region (Fig. 4a, b). Ang mas taas nga kalihokan sa pagsenyas sa GA nakit-an sa mga utlanan sa organ primordium, sugod sa P1 / P2 (sa mga kilid sa utlanan) ug peaking sa P4, ingon man sa tanan nga mga selula sa peripheral nga rehiyon nga nahimutang tali sa primordia (Fig. 4a, b ug Supplementary Fig. 8a, b). Kining mas taas nga kalihokan sa pagsenyas sa GA naobserbahan dili lamang sa epidermis kondili usab sa L2 ug ibabaw nga L3 layers (Supplementary Fig. 8b). Ang sumbanan sa mga signal sa GA nga nakit-an sa SAM gamit ang qmRGA nagpabilin usab nga wala mausab sa paglabay sa panahon (Supplementary Fig. 8c-f, k). Bisan tuod ang pagtukod sa qd17mRGA sistematikong gi-downregulated sa SAM sa T3 nga mga tanum gikan sa lima ka independenteng linya nga among gihulagway sa detalye, nakahimo kami sa pag-analisar sa mga pattern sa fluorescence nga nakuha sa pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP construct (Supplementary Fig. 8g-j, l). Niini nga linya sa pagkontrol, ang gagmay nga mga pagbag-o sa fluorescence ratio ang nakit-an sa SAM, apan sa sentro sa SAM nakita namon ang usa ka tin-aw ug wala damha nga pagkunhod sa VENUS nga nakig-uban sa TagBFP. Gipamatud-an niini nga ang pattern sa pagsenyas nga naobserbahan sa qmRGA nagpakita sa pagkadaot sa nagsalig sa GA sa mRGA-VENUS, apan gipakita usab nga ang qmRGA mahimo’g sobra ang pagtantiya sa kalihokan sa pagsenyas sa GA sa sentro sa meristem. Sa katingbanan, ang among mga resulta nagpadayag usa ka pattern sa pagsenyas sa GA nga panguna nga nagpakita sa pag-apod-apod sa primordia. Kini nga pag-apod-apod sa inter-primordial nga rehiyon (IPR) tungod sa anam-anam nga pagtukod sa taas nga kalihokan sa pagsenyas sa GA tali sa nag-uswag nga primordium ug sa sentral nga rehiyon, samtang sa samang higayon ang kalihokan sa pagsenyas sa GA sa primordium mikunhod (Fig. 4c, d).
Ang pag-apod-apod sa GID1b ug GID1c receptors (tan-awa sa ibabaw) nagsugyot nga ang differential expression sa GA receptors makatabang sa paghulma sa pattern sa GA signaling activity sa SAM. Naghunahuna kami kung mahimo bang maapil ang pagtipon sa pagkalainlain sa GA. Aron masusi kini nga posibilidad, among gigamit ang nlsGPS1 GA FRET sensor21. Ang dugang nga frequency sa pagpaaktibo nakit-an sa SAM sa nlsGPS1 nga gitambalan sa 10 μM GA4 + 7 alang sa 100 min (Supplementary Fig. 9a-e), nga nagpakita nga ang nlsGPS1 nagtubag sa mga pagbag-o sa konsentrasyon sa GA sa SAM, sama sa gibuhat sa roots21. Ang spatial distribution sa nlsGPS1 activation frequency nagpakita nga medyo ubos nga lebel sa GA sa gawas nga mga layer sa SAM, apan nagpakita nga kini gipataas sa sentro ug sa mga utlanan sa SAM (Fig. 4e ug Supplementary Fig. 9a, c). Kini nagsugyot nga ang GA giapod-apod usab sa SAM nga adunay usa ka spatial pattern nga ikatandi sa gipadayag sa qmRGA. Isip usa ka komplementaryong pamaagi, gitratar usab namo ang SAM nga adunay fluorescent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) o Fl nga nag-inusara isip negatibo nga kontrol. Ang Fl signal giapod-apod sa tibuok SAM, lakip ang sentral nga rehiyon ug primordium, bisan pa sa mas ubos nga intensity (Fig. 4j ug Supplementary Fig. 10d). Sa kasukwahi, ang tanan nga tulo ka GA-Fl natipon ilabi na sa sulod sa primordium utlanan ug sa lain-laing mga ang-ang sa uban sa IPR, uban sa GA7-Fl accumulating sa kinadak-ang domain sa IPR (Fig. 4k ug Supplementary Fig. 10a, b). Ang gidaghanon sa fluorescence intensity nagpadayag nga ang IPR ngadto sa non-IPR intensity ratio mas taas sa GA-Fl-treated SAM kumpara sa Fl-treated SAM (Fig. 4l ug Supplementary Fig. 10c). Mag-uban, kini nga mga resulta nagsugyot nga ang GA anaa sa mas taas nga konsentrasyon sa mga selula sa IPR nga nahimutang duol sa utlanan sa organ. Gisugyot niini nga ang sumbanan sa kalihokan sa pagsenyas sa SAM GA nagresulta gikan sa parehas nga pagpahayag sa pagkalainlain sa mga receptor sa GA ug pagtipon sa pagkalainlain sa GA sa mga selula sa IPR duol sa mga utlanan sa organ. Busa, ang among pag-analisar nagpadayag sa usa ka wala damha nga spatiotemporal pattern sa GA signaling, nga adunay ubos nga kalihokan sa sentro ug primordium sa SAM ug mas taas nga kalihokan sa IPR sa peripheral nga rehiyon.
Aron masabtan ang papel sa differential GA signaling activity sa SAM, among gisusi ang correlation tali sa GA signaling activity, cell expansion, ug cell division gamit ang real-time time-lapse imaging sa SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS. Gihatag ang papel sa GA sa regulasyon sa pagtubo, usa ka positibo nga correlation sa mga parameter sa pagpalapad sa cell gilauman. Busa, una namong gitandi ang GA signaling activity nga mga mapa nga adunay mga mapa sa cell surface growth rate (isip usa ka proxy alang sa kusog sa pagpalapad sa cell alang sa usa ka cell ug alang sa anak nga mga selula sa division) ug uban sa mga mapa sa pagtubo anisotropy, nga nagsukod sa direksyon sa pagpalapad sa cell (gigamit usab dinhi alang sa usa ka gihatag nga cell ug alang sa anak nga babaye nga mga selula sa division; Fig. 5a, b, tan-awa ang Mga Pamaagi ug Dugang nga mga Pamaagi). Ang among mga mapa sa SAM cell surface growth rate nahiuyon sa nangaging mga obserbasyon38,39, nga adunay gamay nga pagtubo sa utlanan ug labing taas nga pagtubo sa mga bulak (Fig. 5a). Ang pag-analisa sa punoan nga sangkap (PCA) nagpakita nga ang kalihokan sa pagsenyas sa GA negatibo nga may kalabotan sa intensity sa pagtubo sa nawong sa cell (Figure 5c). Gipakita usab namo nga ang mga nag-unang axes sa variation, lakip ang GA signaling input ug growth intensity, orthogonal sa direksyon nga gitino sa taas nga CLV3 nga ekspresyon, nga nagpamatuod sa dili paglakip sa mga selula gikan sa SAM center sa nahabilin nga mga pag-analisar. Ang pag-analisar sa korelasyon sa Spearman nagpamatuod sa mga resulta sa PCA (Figure 5d), nga nagpakita nga ang mas taas nga mga signal sa GA sa IPR wala magresulta sa mas taas nga pagpalapad sa selula. Bisan pa, ang pag-analisa sa correlation nagpadayag usa ka gamay nga positibo nga correlation tali sa kalihokan sa pagsenyas sa GA ug anisotropy sa pagtubo (Figure 5c, d), nga nagsugyot nga ang mas taas nga pagsenyas sa GA sa IPR nag-impluwensya sa direksyon sa pagtubo sa cell ug posible ang posisyon sa eroplano sa cell division.
a, b Mga mapa sa init sa mean nga pagtubo sa nawong (a) ug anisotropy sa pagtubo (b) sa SAM nga nag-average sa pito ka mga independenteng tanum (gigamit isip mga proxy alang sa kusog ug direksyon sa pagpalapad sa selula, matag usa). Ang pag-analisa sa c PCA naglakip sa mosunod nga mga variable: signal sa GA, intensity sa pagtubo sa nawong, anisotropy sa pagtubo sa nawong, ug ekspresyon sa CLV3. Ang bahin sa PCA 1 nag-una nga negatibo nga may kalabutan sa intensity sa pagtubo sa nawong ug positibo nga may kalabutan sa signal sa GA. Ang bahin sa PCA 2 nag-una nga positibo nga may kalabotan sa anisotropy sa pagtubo sa nawong ug negatibo nga may kalabotan sa ekspresyon sa CLV3. Ang mga porsyento nagrepresentar sa kalainan nga gipatin-aw sa matag sangkap. d Spearman correlation analysis tali sa GA signal, surface growth intensity, ug surface growth anisotropy sa tissue scale walay labot sa CZ. Ang numero sa tuo mao ang Spearman rho nga bili tali sa duha ka variable. Ang mga asterisk nagpakita sa mga kaso diin ang correlation/negative correlation kay mahinungdanon kaayo. e 3D visualization sa Col-0 SAM L1 cells pinaagi sa confocal microscopy. Ang bag-ong mga bungbong sa selula nga naporma sa SAM (apan dili ang primordium) sa 10 ka oras gikoloran sumala sa ilang mga anggulo. Ang color bar gipakita sa ubos nga tuo nga suok. Ang inset nagpakita sa katugbang nga 3D nga hulagway sa 0 h. Ang eksperimento gisubli kaduha nga adunay parehas nga mga resulta. f Box plots nagpakita sa cell division rates sa IPR ug non-IPR Col-0 SAM (n = 10 independenteng mga tanom). Ang sentro nga linya nagpakita sa median, ug ang mga utlanan sa kahon nagpakita sa ika-25 ug ika-75 nga porsyento. Ang mga whisker nagpakita sa minimum ug maximum nga mga bili nga gitino sa R ​​software. Nakuha ang mga kantidad sa P gamit ang two-tailed t-test ni Welch. g, h Schematic diagram nga nagpakita (g) kon unsaon pagsukod ang anggulo sa bag-ong cell wall (magenta) nga may kalabotan sa radial nga direksyon gikan sa sentro sa SAM (white dotted line) (mga acute angle values ​​ra, ie, 0-90 °, ang gikonsiderar), ug (h) ang circumferential/lateral ug radial nga direksyon sulod sa meristem. i Frequency histograms sa cell division plane orientation tabok sa SAM (dark blue), IPR (medium blue), ug non-IPR (light blue), matag usa. Ang mga kantidad sa P nakuha pinaagi sa duha ka ikog nga Kolmogorov-Smirnov nga pagsulay. Ang eksperimento gisubli kaduha nga adunay parehas nga mga resulta. j Frequency histograms sa cell division plane orientation sa IPR sa palibot sa P3 (light green), P4 (medium green), ug P5 (dark green), matag usa. Ang mga kantidad sa P nakuha pinaagi sa duha ka ikog nga Kolmogorov-Smirnov nga pagsulay. Ang eksperimento gisubli kaduha nga adunay parehas nga mga resulta.
Busa, sunod namong gisusi ang correlation tali sa GA signaling ug cell division activity pinaagi sa pag-ila sa bag-ong naporma nga cell wall sa panahon sa assay (Fig. 5e). Kini nga pamaagi nagtugot kanamo sa pagsukod sa frequency ug direksyon sa cell division. Katingad-an, among nahibal-an nga ang frequency sa cell division sa IPR ug ang nahabilin sa SAM (non-IPR, Fig. 5f) managsama, nga nagpakita nga ang mga kalainan sa GA signaling tali sa IPR ug non-IPR nga mga selula dili kaayo makaapekto sa cell division. Kini, ug ang positibo nga correlation tali sa GA signaling ug anisotropy sa pagtubo, nag-aghat kanamo sa paghunahuna kung ang kalihokan sa pagsenyas sa GA mahimong makaimpluwensya sa oryentasyon sa eroplano sa cell division. Gisukod namo ang oryentasyon sa bag-ong cell wall isip usa ka acute angle nga may kalabutan sa radial axis nga nagkonektar sa meristem center ug sa sentro sa bag-ong cell wall (Fig. 5e-i) ug naobserbahan ang usa ka tin-aw nga kalagmitan sa mga selula sa pagbahin sa mga anggulo nga duol sa 90 ° nga may kalabutan sa radial axis, nga adunay labing taas nga frequency nga naobserbahan sa 70 ° 0.8 ° ug 8.8 °. (22.62%) (Fig. 5e, i), nga katumbas sa cell divisions sa circumferential / transverse nga direksyon (Fig. 5h). Aron masusi ang kontribusyon sa GA signaling niini nga kinaiya sa cell division, among gisusi ang mga parameter sa cell division sa IPR ug non-IPR nga gilain (Fig. 5i). Among naobserbahan nga ang division angle distribution sa IPR cells lahi kay sa non-IPR cells o sa mga cell sa tibuok SAM, nga adunay IPR cells nga nagpakita sa mas taas nga proporsiyon sa lateral/circular cell divisions, ie, 70-80 ° ug 80-90 ° (33.86% ug 30.71%, matag usa, katugbang nga proporsyon .5). Busa, ang among mga obserbasyon nagpadayag sa usa ka asosasyon tali sa taas nga GA signaling ug sa usa ka cell division plane orientation duol sa circumferential nga direksyon, susama sa correlation tali sa GA signaling activity ug growth anisotropy (Fig. 5c, d). Aron mas matukod ang spatial conservation niini nga asosasyon, among gisukod ang division plane orientation sa IPR cells nga naglibot sa primordium sugod sa P3, tungod kay ang pinakataas nga GA signaling activity nakit-an niini nga rehiyon sugod sa P4 (Fig. 4). Ang mga anggulo sa pagbahin sa IPR sa palibot sa P3 ug P4 nagpakita nga walay mahinungdanon nga mga kalainan sa istatistika, bisan pa ang usa ka dugang nga frequency sa lateral cell divisions nakita sa IPR sa palibot sa P4 (Fig. 5j). Bisan pa, sa mga selula sa IPR sa palibot sa P5, ang kalainan sa orientasyon sa eroplano sa cell division nahimong mahinungdanon sa istatistika, nga adunay usa ka mahait nga pagtaas sa frequency sa transverse cell divisions (Fig. 5j). Mag-uban, kini nga mga resulta nagsugyot nga ang GA signaling mahimong makontrol ang orientasyon sa mga cell division sa SAM, nga nahiuyon sa nangaging mga taho40,41 nga ang taas nga GA signaling mahimong mag-aghat sa lateral orientation sa mga cell division sa IPR.
Gitagna nga ang mga selula sa IPR dili ilakip sa primordia kondili sa internodes2,42,43. Ang transverse orientation sa cell divisions sa IPR mahimong moresulta sa tipikal nga organisasyon sa parallel longhitudinal row sa epidermal cells sa internodes. Ang among mga obserbasyon nga gihulagway sa ibabaw nagsugyot nga ang GA signaling lagmit adunay papel sa kini nga proseso pinaagi sa pag-regulate sa direksyon sa cell division.
Ang pagkawala sa function sa daghang DELLA genes moresulta sa usa ka constitutive GA nga tubag, ug della mutant mahimong gamiton sa pagsulay niini nga hypothesis44. Una namong gisusi ang mga pattern sa ekspresyon sa lima ka DELLA genes sa SAM. Ang transcriptional fusion sa GUS line45 nagpadayag nga ang GAI, RGA, RGL1, ug RGL2 (sa mas gamay nga gidak-on) gipahayag sa SAM (Supplementary Fig. 11a-d). Sa situ hybridization dugang nagpakita nga GAI mRNA accumulates espesipiko sa primordia ug pagpalambo sa mga bulak (Supplementary Fig. 11e). Ang RGL1 ug RGL3 mRNA nakit-an sa tibuuk nga canopy sa SAM ug sa mga tigulang nga bulak, samtang ang RGL2 mRNA labi ka daghan sa rehiyon sa utlanan (Supplementary Fig. 11f-h). Confocal imaging sa pRGL3 :: Ang RGL3-GFP SAM nagpamatuod sa ekspresyon nga naobserbahan sa in situ hybridization ug nagpakita nga ang RGL3 nga protina natipon sa sentro nga bahin sa SAM (Supplementary Fig. 11i). Gamit ang linya sa pRGA :: GFP-RGA, nakit-an usab namo nga ang protina sa RGA natipon sa SAM, apan ang kadagaya niini mikunhod sa utlanan sugod sa P4 (Supplementary Fig. 11j). Ilabi na, ang mga pattern sa ekspresyon sa RGL3 ug RGA nahiuyon sa mas taas nga kalihokan sa pagsenyas sa GA sa IPR, ingon nga nakita sa qmRGA (Fig. 4). Dugang pa, kini nga mga datos nagpakita nga ang tanan nga mga DELLA gipahayag sa SAM ug nga ang ilang ekspresyon kolektibong naglangkob sa tibuok SAM.
Sunod namong gisusi ang mga parameter sa cell division sa wild-type nga SAM (Ler, control) ug ang gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (Fig. 6a, b). Makapainteres, among naobserbahan ang usa ka mahinungdanong istatistikal nga pagbalhin sa pag-apod-apod sa mga frequency sa anggulo sa cell division sa della global mutant SAM kumpara sa wild type (Fig. 6c). Kini nga pagbag-o sa della global mutant tungod sa pagtaas sa frequency sa 80-90 ° nga mga anggulo (34.71% vs. 24.55%) ug, sa usa ka gamay nga gidak-on, 70-80 ° nga mga anggulo (23.78% vs. 20.18%), ie, katumbas sa transverse cell divisions (Fig. 6c). Ang frequency sa non-transverse divisions (0-60 °) mas ubos usab sa della global mutant (Fig. 6c). Ang frequency sa transverse cell divisions dako nga nadugangan sa SAM sa della global mutant (Fig. 6b). Ang frequency sa transverse cell divisions sa IPR mas taas usab sa della global mutant kumpara sa wild type (Fig. 6d). Sa gawas sa rehiyon sa IPR, ang ihalas nga tipo adunay mas uniporme nga pag-apod-apod sa mga anggulo sa cell division, samtang ang della global mutant gipalabi ang tangential division sama sa IPR (Fig. 6e). Gibanabana usab namo ang oryentasyon sa mga dibisyon sa selula sa SAM sa ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutants (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, ug ga2ox6-2), usa ka GA-inactive mutant background diin ang GA natipon. Nahiuyon sa pagtaas sa lebel sa GA, ang SAM sa quintuple ga2ox mutant inflorescence mas dako kaysa sa Col-0 (Supplementary Fig. 12a, b), ug itandi sa Col-0, ang quintuple ga2ox SAM nagpakita sa usa ka lahi nga lainlain nga pag-apod-apod sa mga anggulo sa pagbahinbahin sa cell, nga ang frequency sa anggulo nga pagtaas gikan sa 50 ° ieential nga pag-usab. 12a–c). Sa ingon, gipakita namon nga ang constitutive activation sa GA signaling ug GA accumulation nag-aghat sa lateral cell divisions sa IPR ug ang nahabilin sa SAM.
a, b 3D visualization sa L1 layer sa PI-stained Ler (a) ug global della mutant (b) SAM gamit ang confocal microscopy. Ang bag-ong mga bungbong sa selula nga naporma sa SAM (apan dili ang primordium) sulod sa 10-h nga panahon gipakita ug gikoloran sumala sa ilang mga anggulo. Ang inset nagpakita sa SAM sa 0 h. Ang color bar gipakita sa ubos nga tuo nga suok. Ang arrow sa (b) nagpunting sa usa ka pananglitan sa mga aligned cell files sa global della mutant. Ang eksperimento gisubli kaduha nga adunay parehas nga mga resulta. ce pagtandi sa frequency distribution sa cell division plane orientations sa tibuok SAM (d), IPR (e), ug non-IPR (f) tali sa Ler ug global della. Ang mga kantidad sa P nakuha gamit ang duha ka ikog nga Kolmogorov-Smirnov nga pagsulay. f, g 3D visualization sa confocal nga mga hulagway sa PI-stained SAM sa Col-0 (i) ug pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) transgenic nga mga tanom. Ang mga panel (a, b) nagpakita sa bag-ong mga bungbong sa selula (apan dili primordia) nga naporma sa SAM sulod sa 10 h. Ang eksperimento gisubli kaduha nga adunay parehas nga mga resulta. h–j Pagkumpara sa frequency distribution sa cell division plane orientations nga nahimutang sa tibuok SAM (h), IPR (i) ug non-IPR (j) tali sa Col-0 ug pCUC2 :: gai-1-VENUS nga mga tanom. Ang mga kantidad sa P nakuha gamit ang duha ka ikog nga Kolmogorov-Smirnov nga pagsulay.
Sunod namong gisulayan ang epekto sa pagpugong sa pagsenyas sa GA ilabi na sa IPR. Alang niini, gigamit namo ang cotyledon cup 2 (CUC2) promoter aron sa pagduso sa ekspresyon sa dominanteng negatibo nga gai-1 nga protina nga gisagol sa VENUS (sa pCUC2 :: gai-1-VENUS line). Sa wild-type nga SAM, ang tigpasiugda sa CUC2 nagduso sa pagpahayag sa kadaghanan sa mga IPR sa SAM, lakip ang mga selula sa utlanan, gikan sa P4 pataas, ug ang parehas nga piho nga ekspresyon naobserbahan sa pCUC2:: gai-1-VENUS nga mga tanum (tan-awa sa ubos). Ang pag-apod-apod sa mga anggulo sa cell division tabok sa SAM o IPR sa pCUC2 :: gai-1-VENUS nga mga tanum dili kaayo lahi gikan sa ihalas nga tipo, bisan kung wala damha nakit-an namon nga ang mga selyula nga wala’y IPR sa kini nga mga tanum gibahin sa mas taas nga frequency sa 80-90 ° (Fig. 6f-j).
Gisugyot nga ang direksyon sa cell division nagdepende sa geometry sa SAM, ilabi na ang tensile stress nga namugna sa tissue curvature46. Busa nangutana kami kung ang porma sa SAM giusab sa della global mutant ug pCUC2:: gai-1-VENUS nga mga tanum. Sama sa gitaho kaniadto12, ang gidak-on sa della global mutant SAM mas dako kaysa sa ihalas nga tipo (Supplementary Fig. 13a, b, d). Sa situ nga hybridization sa CLV3 ug STM RNA nagpamatuod sa pagpalapad sa meristem sa della mutants ug dugang nagpakita sa lateral nga pagpalapad sa stem cell niche (Supplementary Fig. 13e, f, h, i). Bisan pa, ang curvature sa SAM parehas sa parehas nga genotypes (Supplementary Fig. 13k, m, n, p). Naobserbahan namon ang parehas nga pagtaas sa gidak-on sa gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant nga wala’y pagbag-o sa curvature kumpara sa wild type (Supplementary Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). Ang frequency sa cell division orientation naapektuhan usab sa della quadruple mutant, apan sa mas gamay nga gidak-on kay sa della monolithic mutant (Supplementary Fig. 12d-f). Kini nga epekto sa dosis, uban ang kakulang sa epekto sa curvature, nagsugyot nga ang nahabilin nga kalihokan sa RGL3 sa Della quadruple mutant naglimite sa mga pagbag-o sa orientasyon sa cell division tungod sa pagkawala sa kalihokan sa DELLA ug nga ang mga pagbag-o sa mga lateral cell division mahitabo agig tubag sa mga pagbag-o sa kalihokan sa pagsenyas sa GA kaysa mga pagbag-o sa geometry sa SAM. Sama sa gihulagway sa ibabaw, ang tigpasiugda sa CUC2 nagduso sa ekspresyon sa IPR sa SAM sugod sa P4 (Supplementary Fig. 14a, b), ug sa kasukwahi, ang pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM adunay pagkunhod sa gidak-on apan mas taas nga curvature (Supplementary Fig. 14c-h). Kini nga pagbag-o sa pCUC2::gai-1-VENUS SAM morphology mahimong moresulta sa usa ka lahi nga pag-apod-apod sa mekanikal nga mga kapit-os kumpara sa ihalas nga tipo, diin ang taas nga circumferential stress magsugod sa mas mubo nga distansya gikan sa SAM center47. Sa laing bahin, ang mga pagbag-o sa pCUC2:: gai-1-VENUS SAM morphology mahimong moresulta gikan sa mga pagbag-o sa rehiyonal nga mekanikal nga mga kabtangan nga gipahinabo sa transgene nga ekspresyon48. Sa duha ka mga kaso, kini mahimong partially offset sa mga epekto sa mga kausaban sa GA signaling pinaagi sa pagdugang sa kalagmitan nga ang mga selula mabahin sa circumferential / transverse orientation, nga nagpatin-aw sa atong mga obserbasyon.
Sa tingub, ang among datos nagpamatuod nga ang mas taas nga GA signaling adunay aktibong papel sa lateral orientation sa cell division plane sa IPR. Gipakita usab nila nga ang curvature sa meristem nakaimpluwensya usab sa oryentasyon sa eroplano sa cell division sa IPR.
Ang transverse orientation sa division plane sa IPR, tungod sa taas nga GA signaling activity, nagsugyot nga ang GA nag-pre-organize sa usa ka radial cell file sa epidermis sulod sa SAM aron mahibal-an ang cellular nga organisasyon nga makit-an sa ulahi sa epidermal internode. Sa tinuud, ang ingon nga mga file sa cell kanunay nga makita sa mga imahe sa SAM sa della global mutant (Fig. 6b). Busa, aron masusi pa ang developmental function sa spatial pattern sa GA signaling sa SAM, gigamit namo ang time-lapse imaging aron analisahon ang spatial nga organisasyon sa mga selula sa IPR sa wild-type (Ler ug Col-0), della global mutants, ug pCUC2 :: gai-1-VENUS transgenic plants.
Among nakaplagan nga ang qmRGA nagpakita nga ang GA signaling activity sa IPR misaka gikan sa P1/P2 ug mitaas sa P4, ug kini nga pattern nagpabilin nga makanunayon sa paglabay sa panahon (Fig. 4a–f ug Supplementary Fig. 8c–f, k). Aron pag-analisar sa spatial nga organisasyon sa mga selula sa IPR nga adunay pagtaas sa signal sa GA, among gimarkahan ang Ler IPR nga mga selula sa ibabaw ug sa mga kilid sa P4 sumala sa ilang developmental fate nga gisusi 34 h human sa unang obserbasyon, ie, labaw pa sa duha ka plastid nga mga panahon, nga nagtugot kanamo sa pagsunod sa mga selula sa IPR atol sa primordium development gikan sa P1 / P2 ngadto sa P4. Gigamit namo ang tulo ka lain-laing mga kolor: yellow alang niadtong mga selula nga gisagol sa primordium duol sa P4, berde alang niadtong anaa sa IPR, ug purpura alang niadtong miapil sa duha ka proseso (Fig. 7a-c). Sa t0 (0 h), ang 1-2 nga mga lut-od sa mga selula sa IPR makita sa atubangan sa P4 (Fig. 7a). Sama sa gipaabot, sa dihang kini nga mga selula nabahin, sila nag-una pinaagi sa transverse division plane (Fig. 7a–c). Ang susamang mga resulta nakuha gamit ang Col-0 SAM (nagtutok sa P3, kansang utlanan napilo susama sa P4 sa Ler), bisan pa niini nga genotype ang fold nga naporma sa floral border nagtago sa mga selula sa IPR nga mas dali (Fig. 7g-i). Busa, ang sumbanan sa pagbahin sa mga selula sa IPR nag-pre-organisa sa mga selula ngadto sa radial nga mga laray, sama sa internodes. Ang organisasyon sa mga laray sa radial ug ang lokalisasyon sa mga selula sa IPR tali sa sunud-sunod nga mga organo nagsugyot nga kini nga mga selula mga internodal progenitor.
Dinhi, nakahimo kami og ratiometric GA signaling biosensor, qmRGA, nga nagtugot sa quantitative mapping sa GA signaling activity nga resulta sa hiniusang GA ug GA receptor concentrations samtang gipamenos ang interference sa endogenous signaling pathways, sa ingon naghatag og impormasyon sa GA function sa cellular level. Alang niini, nagtukod kami usa ka giusab nga protina sa DELLA, mRGA, nga nawad-an sa katakus sa paggapos sa mga kauban sa interaksyon sa DELLA apan nagpabilin nga sensitibo sa proteolysis nga gipahinabo sa GA. Ang qmRGA nagtubag sa mga exogenous ug endogenous nga mga pagbag-o sa lebel sa GA, ug ang dinamikong sensing nga mga kabtangan niini makahimo sa pagsusi sa mga pagbag-o sa spatiotemporal sa kalihokan sa pagsenyas sa GA sa panahon sa pag-uswag. Ang qmRGA usa usab ka flexible nga himan tungod kay mahimo kini nga ipahiangay sa lainlaing mga tisyu pinaagi sa pagbag-o sa tigpasiugda nga gigamit alang sa pagpahayag niini (kung kinahanglan), ug gihatagan ang gitipig nga kinaiya sa agianan sa pagsenyas sa GA ug ang motibo sa PFYRE sa mga angiosperms, lagmit nga mabalhin kini sa ubang mga species22. Nahiuyon niini, usa ka katumbas nga mutation sa bugas nga SLR1 DELLA nga protina (HYY497AAA) gipakita usab aron pugngan ang kalihokan sa pag-usbaw sa pagtubo sa SLR1 samtang gamay ra ang pagkunhod sa pagkadaot sa GA-mediated, parehas sa mRGA23. Ilabi na, ang bag-ong mga pagtuon sa Arabidopsis nagpakita nga ang usa ka mutation sa amino acid sa PFYRE domain (S474L) nagbag-o sa kalihokan sa transkripsyon sa RGA nga wala makaapekto sa abilidad niini nga makig-uban sa mga kauban sa transcription factor50. Bisan kung kini nga mutation duol kaayo sa 3 ka amino acid substitutions nga naa sa mRGA, gipakita sa among mga pagtuon nga kining duha nga mutation nagbag-o sa lahi nga mga kinaiya sa DELLA. Bisan kung ang kadaghanan sa mga kasosyo sa transcription factor nagbugkos sa LHR1 ug SAW nga mga domain sa DELLA26,51, ang pipila nga gitipig nga mga amino acid sa domain sa PFYRE mahimong makatabang sa pagpalig-on sa kini nga mga interaksyon.
Ang pag-uswag sa internode usa ka hinungdanon nga kinaiya sa arkitektura sa tanum ug pagpaayo sa ani. Gipadayag sa qmRGA ang mas taas nga kalihokan sa pagsenyas sa GA sa IPR internode progenitor cells. Pinaagi sa paghiusa sa quantitative imaging ug genetics, gipakita namo nga ang GA signaling patterns nag-superimpose sa circular/transverse cell division nga mga eroplano sa SAM epidermis, nga naghulma sa cell division nga organisasyon nga gikinahanglan alang sa internode development. Daghang mga regulator sa orientasyon sa eroplano sa cell division ang nahibal-an sa panahon sa pag-uswag52,53. Ang among trabaho naghatag usa ka tin-aw nga pananglitan kung giunsa ang kalihokan sa pagsenyas sa GA nag-regulate sa kini nga cellular parameter. Ang DELLA mahimong makig-uban sa prefolding protein complexes41, mao nga ang GA signaling mahimong mag-regulate sa cell division plane orientation pinaagi sa direktang pag-impluwensya sa cortical microtubule orientation40,41,54,55. Wala namo damha nga gipakita nga sa SAM, ang correlate sa mas taas nga GA signaling activity dili cell elongation o division, apan anisotropy lamang ang pagtubo, nga nahiuyon sa direktang epekto sa GA sa direksyon sa cell division sa IPR. Bisan pa, dili nato iapil nga kini nga epekto mahimo usab nga dili direkta, pananglitan nga gipataliwad-an sa GA-induced cell wall softening56. Ang mga pagbag-o sa mga kabtangan sa cell wall nag-aghat sa mekanikal nga stress57,58, nga mahimo usab nga makaimpluwensya sa orientasyon sa eroplano sa cell division pinaagi sa pag-apekto sa oryentasyon sa cortical microtubules39,46,59. Ang hiniusa nga mga epekto sa mekanikal nga stress nga gipahinabo sa GA ug direkta nga regulasyon sa microtubule orientation pinaagi sa GA mahimong maapil sa pagmugna og usa ka piho nga sumbanan sa orientasyon sa cell division sa IPR aron mahibal-an ang internodes, ug dugang nga mga pagtuon ang gikinahanglan aron masulayan kini nga ideya. Sa susama, ang nangaging mga pagtuon nagpasiugda sa kamahinungdanon sa DELLA-interacting proteins TCP14 ug 15 sa pagkontrolar sa internode formation60,61 ug kini nga mga hinungdan mahimong magpataliwala sa aksyon sa GA uban sa BREVIPEDICELLUS (BP) ug PENNYWISE (PNY), nga nag-regulate sa internode development ug gipakita nga makaimpluwensya sa GA signaling2,62. Gihatag nga ang DELLAs nakig-uban sa brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, ug abscisic acid (ABA) signaling pathways63,64 ug nga kini nga mga hormone makaimpluwensya sa microtubule orientation65, ang mga epekto sa GA sa cell division orientation mahimo usab nga gipataliwala sa ubang mga hormone.
Ang unang mga pagtuon sa cytological nagpakita nga ang sulod ug gawas nga mga rehiyon sa Arabidopsis SAM gikinahanglan alang sa internode development2,42. Ang kamatuoran nga ang GA aktibong nag-regulate sa cell division sa sulod nga mga tisyu12 nagsuporta sa dual function sa GA sa pag-regulate sa meristem ug internode nga gidak-on sa SAM. Ang sumbanan sa direksiyon nga cell division hugot usab nga gi-regulate sa sulod nga SAM tissue, ug kini nga regulasyon kinahanglanon alang sa pagtubo sa tukog52. Makapainteres nga susihon kung ang GA ba usab adunay papel sa pag-orient sa cell division plane sa sulod nga organisasyon sa SAM, sa ingon gi-synchronize ang detalye ug pag-uswag sa mga internode sa sulod sa SAM.
Ang mga tanum gipatubo sa vitro sa yuta o 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) nga gidugangan sa 1% sucrose ug 1% agar (Sigma) ubos sa standard nga kondisyon (16 h light, 22 °C), gawas sa hypocotyl ug root growth experiments diin ang mga seedling gipatubo sa bertikal nga mga plato ubos sa kanunay nga kahayag ug 22 °C. Para sa mga eksperimento sa nitrate, ang mga tanom gipatubo sa modified MS medium (bioWORLD plant medium) nga gidugangan og igong nitrate (0 o 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose ug 1% A-agar (Sigma) ubos sa taas nga adlaw nga mga kondisyon.
Ang GID1a cDNA nga gisulod sa pDONR221 gi-recombined sa pDONR P4-P1R-pUBQ10 ug pDONR P2R-P3-mCherry ngadto sa pB7m34GW aron makamugna og pUBQ10::GID1a-mCherry. Ang IDD2 DNA nga gisulod sa pDONR221 gi-recombine sa pB7RWG266 aron makamugna og p35S:IDD2-RFP. Aron makamugna ang pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b, usa ka 3.9 kb fragment upstream sa GID1b coding region ug usa ka 4.7 kb fragment nga adunay sulod nga GID1b cDNA (1.3 kb) ug terminator (3.4 kb) ang una nga gipadako gamit ang mga primers sa PNR1 ug unya gisulod sa PNR1 Table 3. Fisher Scientific) ug pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), matag usa, ug sa katapusan gihiusa pag-usab sa pDONR221 2xmTQ268 ngadto sa pGreen 012567 target vector gamit ang Gateway cloning. Aron makamugna ang pCUC2 :: LSSmOrange, ang CUC2 promoter sequence (3229 bp upstream sa ATG) gisundan sa coding sequence sa dako nga Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange) 69 nga adunay N7 nuclear localization signal ug ang NOS transcriptional terminator gi-assemble ngadto sa pGreen fragment nga targeting vector nga sistema gamit ang Gateway nga kanamycin recom. (Invitrogen). Ang binary vector sa tanom gipaila ngadto sa Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 ug gipaila ngadto sa Nicotiana benthamiana nga mga dahon pinaagi sa Agrobacterium infiltration method ug ngadto sa Arabidopsis thaliana Col-0 pinaagi sa floral dip method, matag usa. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ug pCLV3::mCherry-NLS qmRGA gilain gikan sa F3 ug F1 progenies sa tagsa-tagsa nga mga krus, sa tinagsa.
Ang RNA in situ hybridization gihimo sa gibana-bana nga 1 cm ang gitas-on sa shoot tips72, nga gikolekta ug diha-diha dayon giayo sa FAA solution (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) pre-cooled ngadto sa 4 °C. Pagkahuman sa 2 × 15 min nga mga pagtambal sa vacuum, ang fixative giusab ug ang mga sample gilumlum sa tibuok gabii. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, ug RGL3 cDNAs ug antisense probes sa ilang 3′-UTRs gi-synthesize gamit ang primers nga gipakita sa Supplementary Table 3 nga gihulagway ni Rosier et al.73. Ang mga probes nga adunay label nga digoxigenin immunodetected gamit ang digoxigenin antibodies (3000-fold dilution; Roche, catalog number: 11 093 274 910), ug ang mga seksyon gimantsa sa 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250-foldlyl phosphate, 250-fold/nitroblue tetrafold)-2. dilution) solusyon.