Ang Quantitative Gibberellin Biosensor Nagpadayag sa Papel sa mga Gibberellins sa Internode Specification sa Shoot Apical Meristem

Ang pagtubo sa apical meristem (SAM) sa mga saha importante kaayo para sa istruktura sa punoan. Mga hormone sa tanommga gibberellinsAng mga (GA) adunay hinungdanong papel sa pag-coordinate sa pagtubo sa tanom, apan ang ilang papel sa SAM wala pa kaayo masabti. Dinhi, nakahimo kami og ratiometric biosensor sa GA signaling pinaagi sa pag-engineer sa DELLA protein aron mapugngan ang hinungdanon nga regulatory function niini sa GA transcriptional response samtang gipreserbar ang pagkadaot niini sa pag-ila sa GA. Gipakita namo nga kini nga degradation-based biosensor tukma nga nagrekord sa mga pagbag-o sa lebel sa GA ug cellular sensing atol sa pag-uswag. Gigamit namo kini nga biosensor aron i-map ang kalihokan sa GA signaling sa SAM. Gipakita namo nga ang taas nga mga signal sa GA anaa kasagaran sa mga selula nga nahimutang taliwala sa organ primordia, nga mga precursor sa mga internode cell. Gamit ang gain- ug loss-of-function approaches, among gipakita pa nga ang GA nag-regulate sa orientation sa cell division plane, nga nagtukod sa canonical cellular organization sa mga internode, sa ingon nagpasiugda sa internode specification sa SAM.
Ang shoot apical meristem (SAM), nga nahimutang sa tumoy sa shoot, adunay niche sa mga stem cell kansang kalihokan nagmugna og mga lateral organ ug stem node sa modular ug iterative nga paagi sa tibuok kinabuhi sa tanom. Ang matag usa niining mga nagbalik-balik nga yunit, o plant node, naglakip sa mga internode ug lateral organ sa mga node, ug mga axillary meristem sa mga axil sa dahon1. Ang pagtubo ug organisasyon sa mga plant node mausab atol sa paglambo. Sa Arabidopsis, ang internodal nga pagtubo gipugngan atol sa vegetative stage, ug ang mga axillary meristem magpabilin nga dormant sa mga axil sa mga dahon sa rosette. Atol sa transisyon ngadto sa floral phase, ang SAM mahimong inflorescence meristem, nga nagmugna og mga elongated internode ug axillary buds, mga branchlet sa mga axil sa mga dahon sa cauline, ug sa ulahi, mga leafless flower2. Bisan tuod nakahimo kita og dakong pag-uswag sa pagsabot sa mga mekanismo nga nagkontrol sa pagsugod sa mga dahon, bulak, ug mga sanga, gamay ra ang nahibal-an kung giunsa pagtungha ang mga internode.
Ang pagsabot sa spatiotemporal distribution sa mga GA makatabang aron mas masabtan ang mga gimbuhaton niining mga hormone sa lain-laing mga tisyu ug sa lain-laing mga yugto sa paglambo. Ang pagtan-aw sa pagkadaot sa RGA-GFP fusion nga gipahayag ubos sa aksyon sa kaugalingon nga promoter naghatag ug importanteng impormasyon sa regulasyon sa kinatibuk-ang lebel sa GA sa mga gamot15,16. Bisan pa, ang ekspresyon sa RGA managlahi sa lain-laing mga tisyu17 ug gi-regulate sa GA18. Busa, ang lain-laing ekspresyon sa RGA promoter mahimong moresulta sa fluorescence pattern nga naobserbahan sa RGA-GFP ug busa kini nga pamaagi dili quantitative. Bag-ohay lang, ang bioactive fluorescein (Fl)-labeled GA19,20 nagpadayag sa akumulasyon sa GA sa root endocortex ug ang regulasyon sa lebel sa cellular niini pinaagi sa GA transport. Bag-ohay lang, ang GA FRET sensor nlsGPS1 nagpakita nga ang lebel sa GA may kalabutan sa elongation sa cell sa mga gamot, filament, ug dark-grown hypocotyls21. Bisan pa, sama sa atong nakita, ang konsentrasyon sa GA dili lamang ang parameter nga nagkontrol sa kalihokan sa GA signaling, tungod kay kini nagdepende sa komplikado nga mga proseso sa sensing. Dinhi, base sa among pagsabot sa mga agianan sa signaling sa DELLA ug GA, among gitaho ang pag-uswag ug pag-ila sa usa ka degradation-based ratiometric biosensor para sa GA signaling. Aron mapalambo kini nga quantitative biosensor, migamit kami og mutant GA-sensitive RGA nga gi-fuse sa usa ka fluorescent protein ug kanunay nga gipahayag sa mga tisyu, ingon man usa ka GA-insensitive fluorescent protein. Gipakita namo nga ang mutant RGA protein fusions dili makabalda sa endogenous GA signaling kung kanunay nga gipahayag, ug nga kini nga biosensor makakwantipika sa kalihokan sa signaling nga resulta sa input sa GA ug pagproseso sa signal sa GA sa sensing apparatus nga adunay taas nga spatiotemporal resolution. Gigamit namo kini nga biosensor aron ma-map ang spatiotemporal distribution sa kalihokan sa signaling sa GA ug makwantipika kung giunsa pag-regulate sa GA ang pamatasan sa cellular sa SAM epidermis. Gipakita namo nga ang GA nag-regulate sa oryentasyon sa division plane sa mga SAM cell nga nahimutang taliwala sa organ primordia, sa ingon nagtino sa canonical cellular organization sa internode.
Sa katapusan, among gipangutana kung ang qmRGA makareport ba sa mga pagbag-o sa endogenous GA levels gamit ang nagtubo nga mga hypocotyl. Gipakita namo kaniadto nga ang nitrate makapadasig sa pagtubo pinaagi sa pagdugang sa GA synthesis ug, sa baylo, sa pagkadaot sa DELLA34. Sumala niana, among naobserbahan nga ang gitas-on sa hypocotyl sa mga seedling nga pUBQ10::qmRGA nga gipatubo ubos sa daghang suplay sa nitrate (10 mM NO3−) mas taas kay sa mga seedling nga gipatubo ubos sa mga kondisyon nga kulang sa nitrate (Supplementary Fig. 6a). Subay sa tubag sa pagtubo, ang mga signal sa GA mas taas sa mga hypocotyl sa mga seedling nga gipatubo ubos sa 10 mM NO3− nga mga kondisyon kaysa sa mga seedling nga gipatubo nga wala’y nitrate (Supplementary Fig. 6b, c). Busa, ang qmRGA nagtugot usab sa pagmonitor sa mga pagbag-o sa GA signaling nga gipahinabo sa endogenous nga mga pagbag-o sa konsentrasyon sa GA.
Aron masabtan kung ang kalihokan sa GA signaling nga namatikdan sa qmRGA nagdepende ba sa konsentrasyon sa GA ug persepsyon sa GA, sama sa gilauman base sa disenyo sa sensor, among gisusi ang ekspresyon sa tulo ka GID1 receptor sa vegetative ug reproductive tissues. Sa mga semilya, ang GID1-GUS reporter line nagpakita nga ang GID1a ug c taas ang ekspresyon sa mga cotyledon (Fig. 3a–c). Dugang pa, ang tanang tulo ka receptor gipahayag sa mga dahon, lateral root primordia, mga tumoy sa gamot (gawas sa root cap sa GID1b), ug sa vascular system (Fig. 3a–c). Sa inflorescence SAM, among nakita ang mga GUS signal para lamang sa GID1b ug 1c (Supplementary Fig. 7a–c). Ang in situ hybridization nagpamatuod niining mga expression pattern ug dugang nga nagpakita nga ang GID1c parehas nga gipahayag sa ubos nga lebel sa SAM, samtang ang GID1b nagpakita og mas taas nga ekspresyon sa periphery sa SAM (Supplementary Fig. 7d–l). Ang pGID1b::2xmTQ2-GID1b translational fusion nagpadayag usab og graded range sa GID1b expression, gikan sa ubos o walay expression sa sentro sa SAM ngadto sa taas nga expression sa organ borders (Supplementary Fig. 7m). Busa, ang GID1 receptors dili parehas nga naapod-apod sa tibuok ug sulod sa mga tisyu. Sa sunod nga mga eksperimento, among naobserbahan usab nga ang overexpression sa GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) nagdugang sa sensitivity sa qmRGA sa mga hypocotyls ngadto sa external GA application (Fig. 3d, e). Sa kasukwahi, ang fluorescence nga gisukod sa qd17mRGA sa hypocotyl dili sensitibo sa GA3 treatment (Fig. 3f, g). Alang sa duha ka assays, ang mga seedlings gitambalan og taas nga konsentrasyon sa GA (100 μM GA3) aron masusi ang paspas nga kinaiya sa sensor, diin ang abilidad sa paggapos sa GID1 receptor napalambo o nawala. Kini nga mga resulta nagpamatuod nga ang qmRGA biosensor nagsilbi og hiniusa nga gimbuhaton isip GA ug GA sensor, ug nagsugyot nga ang lain-laing ekspresyon sa GID1 receptor mahimong maka-modulate pag-ayo sa emissivity sa sensor.
Hangtod karon, ang distribusyon sa mga signal sa GA sa SAM nagpabilin nga dili klaro. Busa, among gigamit ang qmRGA-expressing plants ug ang pCLV3::mCherry-NLS stem cell reporter35 aron makalkulo ang high-resolution quantitative maps sa GA signaling activity, nga nagpunting sa L1 layer (epidermis; Fig. 4a, b, tan-awa ang Methods ug Supplementary Methods), tungod kay ang L1 adunay hinungdanong papel sa pagkontrol sa pagtubo sa SAM36. Dinhi, ang pCLV3::mCherry-NLS expression naghatag ug fixed geometric reference point para sa pag-analisar sa spatiotemporal distribution sa GA signaling activity37. Bisan tuod ang GA giisip nga importante para sa lateral organ development4, among naobserbahan nga ang mga signal sa GA ubos sa floral primordium (P) sugod sa P3 stage (Fig. 4a, b), samtang ang mga batan-ong P1 ug P2 primordium adunay kasarangan nga kalihokan nga susama sa naa sa central region (Fig. 4a, b). Mas taas nga kalihokan sa GA signaling ang nakita sa mga utlanan sa organ primordium, sugod sa P1/P2 (sa mga kilid sa utlanan) ug miabot sa kinapungkayan sa P4, ingon man sa tanang selula sa peripheral nga rehiyon nga nahimutang taliwala sa primordia (Fig. 4a, b ug Supplementary Fig. 8a, b). Kini nga mas taas nga kalihokan sa GA signaling naobserbahan dili lamang sa epidermis apan lakip usab sa L2 ug ibabaw nga mga layer sa L3 (Supplementary Fig. 8b). Ang sumbanan sa mga signal sa GA nga nakita sa SAM gamit ang qmRGA nagpabilin usab nga wala mausab sa paglabay sa panahon (Supplementary Fig. 8c–f, k). Bisan tuod ang qd17mRGA construct sistematikong gipaubos sa SAM sa mga tanom nga T3 gikan sa lima ka independente nga linya nga among gihulagway sa detalye, among nasusi ang mga sumbanan sa fluorescence nga nakuha gamit ang pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP construct (Supplementary Fig. 8g–j, l). Niini nga control line, gagmay ra nga mga pagbag-o sa fluorescence ratio ang nakita sa SAM, apan sa sentro sa SAM among naobserbahan ang usa ka klaro ug wala damha nga pagkunhod sa VENUS nga nalangkit sa TagBFP. Kini nagpamatuod nga ang signaling pattern nga naobserbahan sa qmRGA nagpakita sa GA-dependent degradation sa mRGA-VENUS, apan nagpakita usab nga ang qmRGA mahimong mo-overestimate sa GA signaling activity sa meristem center. Sa kinatibuk-an, ang among mga resulta nagpadayag sa usa ka GA signaling pattern nga panguna nga nagpakita sa distribusyon sa primordia. Kini nga distribusyon sa inter-primordial region (IPR) tungod sa hinay-hinay nga pagtukod sa taas nga GA signaling activity tali sa nag-uswag nga primordium ug sa central region, samtang sa samang higayon ang GA signaling activity sa primordium mikunhod (Fig. 4c, d).
Ang distribusyon sa mga GID1b ug GID1c receptor (tan-awa sa ibabaw) nagsugyot nga ang lain-laing ekspresyon sa mga GA receptor makatabang sa paghulma sa sumbanan sa kalihokan sa GA signaling sa SAM. Naghunahuna kami kung ang lain-laing akumulasyon sa GA mahimong nalambigit. Aron imbestigahan kini nga posibilidad, gigamit namo ang nlsGPS1 GA FRET sensor21. Namatikdan ang dugang nga activation frequency sa SAM sa nlsGPS1 nga gitambalan og 10 μM GA4+7 sulod sa 100 min (Supplementary Fig. 9a–e), nga nagpakita nga ang nlsGPS1 mitubag sa mga pagbag-o sa konsentrasyon sa GA sa SAM, sama sa gibuhat niini sa mga gamot21. Ang spatial distribution sa nlsGPS1 activation frequency nagpadayag sa medyo ubos nga lebel sa GA sa gawas nga mga lut-od sa SAM, apan nagpakita nga kini gipataas sa sentro ug sa mga utlanan sa SAM (Fig. 4e ug Supplementary Fig. 9a,c). Kini nagsugyot nga ang GA giapod-apod usab sa SAM nga adunay spatial pattern nga ikatandi sa gipakita sa qmRGA. Isip usa ka komplementaryong pamaagi, among gitratar usab ang SAM gamit ang fluorescent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) o Fl lamang isip negatibong kontrol. Ang Fl signal naapod-apod sa tibuok SAM, lakip ang sentral nga rehiyon ug primordium, bisan pa sa mas ubos nga intensidad (Fig. 4j ug Supplementary Fig. 10d). Sa kasukwahi, ang tanang tulo ka GA-Fl natipon ilabi na sulod sa mga utlanan sa primordium ug sa lain-laing ang-ang sa nahabilin nga IPR, diin ang GA7-Fl natipon sa pinakadako nga domain sa IPR (Fig. 4k ug Supplementary Fig. 10a,b). Ang kwantipikasyon sa intensidad sa fluorescence nagpadayag nga ang IPR ngadto sa non-IPR intensity ratio mas taas sa GA-Fl-treated SAM kon itandi sa Fl-treated SAM (Fig. 4l ug Supplementary Fig. 10c). Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagsugyot nga ang GA anaa sa mas taas nga konsentrasyon sa mga selula sa IPR nga nahimutang duol sa utlanan sa organ. Kini nagsugyot nga ang sumbanan sa kalihokan sa signaling sa SAM GA resulta sa parehong lain-laing ekspresyon sa mga receptor sa GA ug lain-laing akumulasyon sa GA sa mga selula sa IPR duol sa mga utlanan sa organ. Busa, ang among pag-analisar nagbutyag sa usa ka wala damha nga spatiotemporal nga sumbanan sa GA signaling, nga adunay mas ubos nga kalihokan sa sentro ug primordium sa SAM ug mas taas nga kalihokan sa IPR sa peripheral nga rehiyon.
Aron masabtan ang papel sa differential GA signaling activity sa SAM, among gisusi ang correlation tali sa GA signaling activity, cell expansion, ug cell division gamit ang real-time time-lapse imaging sa SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Tungod sa papel sa GA sa growth regulation, gilauman ang positibong correlation sa cell expansion parameters. Busa, among gitandi una ang GA signaling activity maps sa mga mapa sa cell surface growth rate (isip proxy sa kusog sa cell expansion para sa usa ka gihatag nga cell ug para sa daughter cells sa division) ug sa mga mapa sa growth anisotropy, nga nagsukod sa directionality sa cell expansion (gigamit usab dinhi para sa usa ka gihatag nga cell ug para sa daughter cells sa division; Fig. 5a,b, tan-awa ang Methods ug Supplementary Methods). Ang among mga mapa sa SAM cell surface growth rate nahiuyon sa nangaging mga obserbasyon38,39, nga adunay gamay nga growth rates sa border ug maximal growth rates sa nag-uswag nga mga bulak (Fig. 5a). Ang principal component analysis (PCA) nagpakita nga ang GA signaling activity negatibo nga nakig-uban sa intensity sa cell surface growth (Figure 5c). Gipakita usab namo nga ang mga nag-unang axes of variation, lakip ang GA signaling input ug growth intensity, kay orthogonal sa direksyon nga gitino sa taas nga CLV3 expression, nga nagpamatuod sa pag-exclude sa mga cell gikan sa SAM center sa nahibiling mga analysis. Gikumpirma sa Spearman correlation analysis ang mga resulta sa PCA (Figure 5d), nga nagpakita nga ang mas taas nga GA signals sa IPR wala moresulta sa mas taas nga cell expansion. Bisan pa, ang correlation analysis nagpadayag ug gamay nga positibo nga correlation tali sa GA signaling activity ug growth anisotropy (Figure 5c, d), nga nagsugyot nga ang mas taas nga GA signaling sa IPR nakaimpluwensya sa direksyon sa pagtubo sa cell ug posible sa posisyon sa cell division plane.
a, b Mga mapa sa kainit sa mean surface growth (a) ug growth anisotropy (b) sa SAM nga gi-average sa pito ka independente nga mga tanom (gigamit isip mga proxy para sa kusog ug direksyon sa pagpalapad sa selula, matag usa). c Ang pag-analisa sa PCA naglakip sa mosunod nga mga variable: GA signal, surface growth intensity, surface growth anisotropy, ug CLV3 expression. Ang PCA component 1 kasagaran negatibo nga nakig-uban sa surface growth intensity ug positibo nga nakig-uban sa GA signal. Ang PCA component 2 kasagaran positibo nga nakig-uban sa surface growth anisotropy ug negatibo nga nakig-uban sa CLV3 expression. Ang mga porsyento nagrepresentar sa kalainan nga gipasabut sa matag component. d Spearman correlation analysis tali sa GA signal, surface growth intensity, ug surface growth anisotropy sa tissue scale gawas sa CZ. Ang numero sa tuo mao ang Spearman rho value tali sa duha ka variable. Ang mga asterisk nagpakita sa mga kaso diin ang correlation/negative correlation importante kaayo. e 3D visualization sa Col-0 SAM L1 cells pinaagi sa confocal microscopy. Ang bag-ong mga cell wall nga naporma sa SAM (apan dili ang primordium) sa 10 ka oras gikoloran sumala sa ilang mga angle value. Ang color bar gipakita sa ubos nga tuo nga suok. Ang inset nagpakita sa katugbang nga 3D nga imahe sa 0 h. Ang eksperimento gisubli kaduha nga adunay parehas nga mga resulta. f Ang mga box plot nagpakita sa mga rate sa pagbahin sa cell sa IPR ug non-IPR Col-0 SAM (n = 10 independente nga mga tanum). Ang linya sa tunga nagpakita sa median, ug ang mga utlanan sa kahon nagpakita sa ika-25 ug ika-75 nga percentile. Ang mga whisker nagpakita sa minimum ug maximum nga mga kantidad nga gitino gamit ang R software. Ang mga P nga kantidad nakuha gamit ang two-tailed t-test ni Welch. g, h Ang eskematiko nga diagram nga nagpakita (g) kung giunsa pagsukod ang anggulo sa bag-ong cell wall (magenta) kalabot sa radial nga direksyon gikan sa sentro sa SAM (puti nga tuldok-tuldok nga linya) (ang mga kantidad sa acute angle lamang, ie, 0–90°, ang gikonsiderar), ug (h) ang circumferential/lateral ug radial nga mga direksyon sulod sa meristem. i Mga frequency histogram sa oryentasyon sa cell division plane sa tibuok SAM (itom nga asul), IPR (medium nga asul), ug non-IPR (gaan nga asul), matag usa. Ang mga P value nakuha pinaagi sa two-tailed Kolmogorov-Smirnov test. Ang eksperimento gisubli kaduha nga adunay parehas nga mga resulta. j Mga frequency histogram sa oryentasyon sa cell division plane sa IPR palibot sa P3 (light green), P4 (medium green), ug P5 (dark green), matag usa. Ang mga P value nakuha pinaagi sa two-tailed Kolmogorov-Smirnov test. Ang eksperimento gisubli kaduha nga adunay parehas nga mga resulta.
Busa, among gisusi sunod ang korelasyon tali sa GA signaling ug kalihokan sa cell division pinaagi sa pag-ila sa bag-ong naporma nga mga cell wall atol sa assay (Fig. 5e). Kini nga pamaagi nagtugot kanamo sa pagsukod sa frequency ug direksyon sa cell division. Nakurat kami nga nakita nga ang frequency sa cell divisions sa IPR ug sa nahabilin nga SAM (non-IPR, Fig. 5f) parehas, nga nagpakita nga ang mga kalainan sa GA signaling tali sa IPR ug non-IPR cells wala kaayo makaapekto sa cell division. Kini, ug ang positibo nga korelasyon tali sa GA signaling ug growth anisotropy, nag-aghat kanamo sa pagkonsiderar kung ang kalihokan sa GA signaling makaimpluwensya ba sa oryentasyon sa cell division plane. Among gisukod ang oryentasyon sa bag-ong cell wall isip usa ka acute angle relative sa radial axis nga nagkonektar sa meristem center ug sa sentro sa bag-ong cell wall (Fig. 5e-i) ug nakita ang klaro nga tendensya sa mga cell nga mabahin sa mga anggulo nga duol sa 90° relative sa radial axis, diin ang pinakataas nga frequency naobserbahan sa 70–80° (23.28%) ug 80–90° (22.62%) (Fig. 5e,i), nga katumbas sa mga cell division sa circumferential/transverse direction (Fig. 5h). Aron masusi ang kontribusyon sa GA signaling niining cell division behavior, among gisusi ang mga cell division parameter sa IPR ug non-IPR nga gilain (Fig. 5i). Among naobserbahan nga ang distribusyon sa division angle sa mga IPR cell lahi sa mga non-IPR cell o sa mga cell sa tibuok SAM, diin ang mga IPR cell nagpakita og mas taas nga proporsyon sa lateral/circular cell divisions, ie, 70–80° ug 80–90° (33.86% ug 30.71%, matag usa, katugbang nga proporsyon) (Fig. 5i). Busa, ang among mga obserbasyon nagpadayag og asosasyon tali sa taas nga GA signaling ug usa ka cell division plane orientation nga duol sa circumferential direction, susama sa correlation tali sa GA signaling activity ug growth anisotropy (Fig. 5c, d). Aron mas mapamatud-an ang spatial conservation niini nga asosasyon, among gisukod ang division plane orientation sa mga IPR cell nga naglibot sa primordium sugod sa P3, tungod kay ang pinakataas nga GA signaling activity nakita niini nga rehiyon sugod sa P4 (Fig. 4). Ang division angles sa IPR palibot sa P3 ug P4 wala magpakita og statistically significant nga mga kalainan, bisan pa og naobserbahan ang dugang nga frequency sa lateral cell divisions sa IPR palibot sa P4 (Fig. 5j). Apan, sa mga IPR cells palibot sa P5, ang kalainan sa oryentasyon sa cell division plane nahimong statistically significant, nga adunay kusog nga pagtaas sa frequency sa transverse cell divisions (Fig. 5j). Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagsugyot nga ang GA signaling makakontrol sa oryentasyon sa mga cell divisions sa SAM, nga nahiuyon sa nangaging mga report40,41 nga ang taas nga GA signaling makaaghat sa lateral orientation sa mga cell divisions sa IPR.
Gitagna nga ang mga selula sa IPR dili ilakip sa primordia apan ngadto sa mga internode2,42,43. Ang transverse orientation sa mga cell division sa IPR mahimong moresulta sa tipikal nga organisasyon sa parallel longitudinal rows sa mga epidermal cell sa mga internode. Ang among mga obserbasyon nga gihulagway sa ibabaw nagsugyot nga ang GA signaling lagmit adunay papel niini nga proseso pinaagi sa pag-regulate sa direksyon sa cell division.
Ang pagkawala sa gimbuhaton sa daghang mga gene sa DELLA moresulta sa usa ka constitutive GA response, ug ang mga della mutant mahimong gamiton aron masulayan kini nga hypothesis44. Una namong gisusi ang mga pattern sa ekspresyon sa lima ka mga gene sa DELLA sa SAM. Ang transcriptional fusion sa GUS line45 nagpadayag nga ang GAI, RGA, RGL1, ug RGL2 (sa mas gamay nga sukod) gipahayag sa SAM (Supplementary Fig. 11a–d). Ang in situ hybridization dugang nga nagpakita nga ang GAI mRNA nagtipon ilabi na sa primordia ug nag-uswag nga mga bulak (Supplementary Fig. 11e). Ang RGL1 ug RGL3 mRNA nakita sa tibuok SAM canopy ug sa mas tigulang nga mga bulak, samtang ang RGL2 mRNA mas daghan sa border region (Supplementary Fig. 11f–h). Ang confocal imaging sa pRGL3::RGL3-GFP SAM nagpamatuod sa ekspresyon nga naobserbahan sa in situ hybridization ug nagpakita nga ang RGL3 protein nagtipon sa sentral nga bahin sa SAM (Supplementary Fig. 11i). Gamit ang linya sa pRGA::GFP-RGA, among nakita usab nga ang protina sa RGA natipon sa SAM, apan ang kadagaya niini mikunhod sa utlanan sugod sa P4 (Supplementary Fig. 11j). Talalupangdon nga ang mga sumbanan sa ekspresyon sa RGL3 ug RGA nahiuyon sa mas taas nga kalihokan sa pag-signal sa GA sa IPR, sama sa nakita sa qmRGA (Fig. 4). Dugang pa, kini nga datos nagpakita nga ang tanan nga mga DELLA gipahayag sa SAM ug nga ang ilang ekspresyon kolektibo nga naglangkob sa tibuuk nga SAM.
Sunod namong gisusi ang mga parametro sa cell division sa wild-type SAM (Ler, control) ug ang gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (Fig. 6a, b). Makapainteres, among naobserbahan ang usa ka istatistikal nga hinungdanon nga pagbalhin sa distribusyon sa mga frequency sa anggulo sa cell division sa della global mutant SAM kon itandi sa wild type (Fig. 6c). Kini nga pagbag-o sa della global mutant tungod sa pagtaas sa frequency sa 80–90° nga anggulo (34.71% vs. 24.55%) ug, sa mas gamay nga sukod, 70–80° nga anggulo (23.78% vs. 20.18%), ie, katumbas sa transverse cell divisions (Fig. 6c). Ang frequency sa non-transverse divisions (0–60°) mas ubos usab sa della global mutant (Fig. 6c). Ang frequency sa transverse cell divisions miusbaw pag-ayo sa SAM sa della global mutant (Fig. 6b). Mas taas usab ang frequency sa transverse cell divisions sa IPR sa della global mutant kon itandi sa wild type (Fig. 6d). Gawas sa rehiyon sa IPR, ang wild type adunay mas parehas nga distribusyon sa mga anggulo sa cell division, samtang ang della global mutant mas gusto ang tangential divisions sama sa IPR (Fig. 6e). Gikwenta usab namo ang oryentasyon sa mga cell divisions sa SAM sa ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutants (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, ug ga2ox6-2), usa ka GA-inactive mutant background diin ang GA magtigom. Subay sa pagsaka sa lebel sa GA, ang SAM sa quintuple ga2ox mutant inflorescence mas dako kay sa Col-0 (Supplementary Fig. 12a, b), ug kon itandi sa Col-0, ang quintuple ga2ox SAM nagpakita og lahi nga distribusyon sa mga anggulo sa cell division, diin ang angle frequency misaka gikan sa 50° ngadto sa 90°, buot ipasabot, pabor usab sa tangential divisions (Supplementary Fig. 12a–c). Busa, among gipakita nga ang constitutive activation sa GA signaling ug GA accumulation nag-induce sa lateral cell divisions sa IPR ug sa uban pang bahin sa SAM.
a, b 3D visualization sa L1 layer sa PI-stained Ler (a) ug global della mutant (b) SAM gamit ang confocal microscopy. Ang bag-ong mga cell wall nga naporma sa SAM (apan dili ang primordium) sulod sa 10 ka oras nga panahon gipakita ug gikoloran sumala sa ilang mga anggulo. Ang inset nagpakita sa SAM sa 0 ka oras. Ang color bar gipakita sa ubos nga tuo nga suok. Ang pana sa (b) nagtudlo sa usa ka pananglitan sa gi-align nga mga cell file sa global della mutant. Ang eksperimento gisubli kaduha nga adunay parehas nga mga resulta. ce pagtandi sa frequency distribution sa mga orientation sa cell division plane sa tibuok SAM (d), IPR (e), ug non-IPR (f) tali sa Ler ug global della. Ang mga P value nakuha gamit ang two-tailed Kolmogorov-Smirnov test. f, g 3D visualization sa confocal images sa PI-stained SAM sa Col-0 (i) ug pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgenic nga mga tanom. Ang mga panel (a, b) nagpakita sa bag-ong mga cell wall (apan dili ang primordia) nga naporma sa SAM sulod sa 10 ka oras. Ang eksperimento gisubli kaduha nga adunay parehas nga mga resulta. h–j Pagtandi sa frequency distribution sa mga oryentasyon sa cell division plane nga nahimutang sa tibuok SAM (h), IPR (i) ug non-IPR (j) tali sa Col-0 ug pCUC2::gai-1-VENUS nga mga tanom. Ang mga P value nakuha gamit ang two-tailed Kolmogorov–Smirnov test.
Sunod namong gisulayan ang epekto sa pagpugong sa GA signaling ilabi na sa IPR. Tungod niini, among gigamit ang cotyledon cup 2 (CUC2) promoter aron mapadali ang ekspresyon sa usa ka dominanteng negatibo nga gai-1 nga protina nga gihiusa sa VENUS (sa linya sa pCUC2::gai-1-VENUS). Sa wild-type nga SAM, ang CUC2 promoter ang nagpadali sa ekspresyon sa kadaghanan sa mga IPR sa SAM, lakip ang mga border cell, gikan sa P4 pataas, ug parehas nga piho nga ekspresyon ang naobserbahan sa mga tanom nga pCUC2::gai-1-VENUS (tan-awa sa ubos). Ang pag-apod-apod sa mga anggulo sa pagbahin sa selula sa tibuok SAM o IPR sa mga tanom nga pCUC2::gai-1-VENUS wala’y dakong kalainan gikan sa wild type, bisan kung wala damha nga among nakit-an nga ang mga selula nga walay IPR niini nga mga tanom nabahin sa mas taas nga frequency nga 80–90° (Fig. 6f–j).
Gisugyot nga ang direksyon sa pagbahin sa selula nagdepende sa geometry sa SAM, ilabi na ang tensile stress nga namugna sa tissue curvature46. Busa, among gipangutana kung ang porma sa SAM nausab ba sa della global mutant ug pCUC2::gai-1-VENUS nga mga tanom. Sama sa gitaho kaniadto12, ang gidak-on sa della global mutant SAM mas dako kay sa wild type (Supplementary Fig. 13a, b, d). Ang in situ hybridization sa CLV3 ug STM RNA nagpamatuod sa pagpalapad sa meristem sa della mutants ug dugang nga nagpakita sa lateral expansion sa stem cell niche (Supplementary Fig. 13e, f, h, i). Bisan pa, ang SAM curvature parehas sa duha ka genotype (Supplementary Fig. 13k, m, n, p). Nakamatikod kami og parehas nga pagtaas sa gidak-on sa gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant nga walay pagbag-o sa curvature kon itandi sa wild type (Supplementary Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). Ang frequency sa cell division orientation naapektuhan usab sa della quadruple mutant, apan sa mas gamay nga sukod kaysa sa della monolithic mutant (Supplementary Fig. 12d–f). Kini nga dosage effect, uban sa kakulang sa epekto sa curvature, nagsugyot nga ang residual RGL3 activity sa Della quadruple mutant naglimite sa mga pagbag-o sa cell division orientation nga gipahinabo sa pagkawala sa DELLA activity ug nga ang mga pagbag-o sa lateral cell divisions mahitabo isip tubag sa mga pagbag-o sa GA signaling activity imbes nga mga pagbag-o sa SAM geometry. Sama sa gihulagway sa ibabaw, ang CUC2 promoter nagduso sa IPR expression sa SAM sugod sa P4 (Supplementary Fig. 14a, b), ug sa kasukwahi, ang pCUC2::gai-1-VENUS SAM adunay gamay nga gidak-on apan mas taas nga curvature (Supplementary Fig. 14c–h). Kini nga pagbag-o sa pCUC2::gai-1-VENUS SAM morphology mahimong moresulta sa lahi nga distribution sa mechanical stresses kon itandi sa wild type, diin ang taas nga circumferential stresses magsugod sa mas mubo nga distansya gikan sa SAM center47. Sa laing bahin, ang mga pagbag-o sa pCUC2::gai-1-VENUS SAM morphology mahimong resulta sa mga pagbag-o sa rehiyonal nga mekanikal nga mga kabtangan nga gipahinabo sa transgene expression48. Sa duha ka mga kaso, kini mahimong partially offset sa mga epekto sa mga pagbag-o sa GA signaling pinaagi sa pagdugang sa posibilidad nga ang mga selula mabahin sa circumferential/transverse orientation, nga nagpatin-aw sa among mga obserbasyon.
Kon tan-awon sa kinatibuk-an, ang among datos nagpamatuod nga ang mas taas nga GA signaling adunay aktibong papel sa lateral orientation sa cell division plane sa IPR. Gipakita usab niini nga ang meristem curvature nakaimpluwensya usab sa orientation sa cell division plane sa IPR.
Ang transverse orientation sa division plane sa IPR, tungod sa taas nga GA signaling activity, nagsugyot nga ang GA nag-pre-organize sa radial cell file sa epidermis sulod sa SAM aron i-define ang cellular organization nga sa ulahi makita sa epidermal internode. Sa tinuod lang, ang ingon nga mga cell file kanunay nga makita sa mga SAM image sa della global mutants (Fig. 6b). Busa, aron mas masusi ang developmental function sa spatial pattern sa GA signaling sa SAM, migamit kami og time-lapse imaging aron analisahon ang spatial organization sa mga cell sa IPR sa wild-type (Ler ug Col-0), della global mutants, ug pCUC2::gai-1-VENUS transgenic plants.
Among nakita nga ang qmRGA nagpakita nga ang kalihokan sa GA signaling sa IPR misaka gikan sa P1/P2 ug miabot sa kinapungkayan sa P4, ug kini nga sumbanan nagpabilin nga makanunayon sa paglabay sa panahon (Fig. 4a–f ug Supplementary Fig. 8c–f, k). Aron ma-analisa ang spatial organization sa mga selula sa IPR nga adunay nagkataas nga signal sa GA, among gimarkahan ang mga selula sa Ler IPR sa ibabaw ug sa mga kilid sa P4 sumala sa ilang developmental fate nga gi-analisa 34 ka oras human sa unang obserbasyon, ie, sobra sa duha ka plastid times, nga nagtugot kanamo sa pagsunod sa mga selula sa IPR atol sa primordium development gikan sa P1/P2 ngadto sa P4. Migamit kami og tulo ka lain-laing kolor: dilaw para sa mga selula nga gi-integrate sa primordium duol sa P4, berde para sa mga naa sa IPR, ug purpura para sa mga miapil sa duha ka proseso (Fig. 7a–c). Sa t0 (0 h), 1–2 ka layer sa mga selula sa IPR ang makita sa atubangan sa P4 (Fig. 7a). Sama sa gilauman, sa dihang kini nga mga selula nabahin, kini gibuhat nila labi na pinaagi sa transverse division plane (Figs. 7a–c). Parehas nga mga resulta ang nakuha gamit ang Col-0 SAM (nga nagpunting sa P3, kansang utlanan mopilo nga susama sa P4 sa Ler), bisan kung niini nga genotype ang pilo nga naporma sa utlanan sa bulak mas paspas nga nagtago sa mga selula sa IPR (Fig. 7g–i). Busa, ang sumbanan sa pagbahin sa mga selula sa IPR nag-organisar daan sa mga selula ngadto sa mga radial row, sama sa mga internode. Ang organisasyon sa mga radial row ug ang lokalisasyon sa mga selula sa IPR taliwala sa sunod-sunod nga mga organo nagsugyot nga kini nga mga selula mga internodal progenitor.
Dinhi, naghimo kami og ratiometric GA signaling biosensor, qmRGA, nga nagtugot sa quantitative mapping sa GA signaling activity nga resulta sa hiniusa nga GA ug GA receptor concentrations samtang gipakunhod ang interference sa endogenous signaling pathways, sa ingon naghatag og impormasyon sa GA function sa cellular level. Tungod niini, naghimo kami og giusab nga DELLA protein, mRGA, nga nawad-an sa abilidad sa paggapos sa DELLA interaction partners apan nagpabilin nga sensitibo sa GA-induced proteolysis. Ang qmRGA motubag sa exogenous ug endogenous nga mga pagbag-o sa GA levels, ug ang dynamic sensing properties niini nagtugot sa pagtimbang-timbang sa spatiotemporal nga mga pagbag-o sa GA signaling activity atol sa pag-uswag. Ang qmRGA usa usab ka flexible nga himan tungod kay kini mahimong ipahiangay sa lain-laing mga tisyu pinaagi sa pag-usab sa promoter nga gigamit alang sa ekspresyon niini (kung kinahanglan), ug tungod sa conserved nature sa GA signaling pathway ug sa PFYRE motif sa mga angiosperms, kini lagmit nga mabalhin ngadto sa ubang mga species22. Subay niini, ang katumbas nga mutation sa rice SLR1 DELLA protein (HYY497AAA) gipakita usab nga makapugong sa growth repressor activity sa SLR1 samtang gamay ra ang pagkunhod sa GA-mediated degradation niini, susama sa mRGA23. Ilabi na, ang bag-o nga mga pagtuon sa Arabidopsis nagpakita nga ang usa ka amino acid mutation sa PFYRE domain (S474L) nakausab sa transcriptional activity sa RGA nga wala makaapekto sa abilidad niini sa pagpakig-uban sa transcription factor partners50. Bisan tuod kini nga mutation duol kaayo sa 3 ka amino acid substitutions nga anaa sa mRGA, ang among mga pagtuon nagpakita nga kini nga duha ka mutation nakausab sa managlahing kinaiya sa DELLA. Bisan tuod kadaghanan sa transcription factor partners nagbugkos sa LHR1 ug SAW domains sa DELLA26,51, ang pipila ka conserved amino acids sa PFYRE domain makatabang sa pagpalig-on niini nga mga interaksyon.
Ang paglambo sa internode usa ka importanteng kinaiya sa arkitektura sa tanom ug pag-uswag sa ani. Ang qmRGA nagpakita og mas taas nga kalihokan sa GA signaling sa IPR internode progenitor cells. Pinaagi sa paghiusa sa quantitative imaging ug genetics, among gipakita nga ang mga pattern sa GA signaling nagpatong sa circular/transverse cell division planes sa SAM epidermis, nga naghulma sa organisasyon sa cell division nga gikinahanglan alang sa paglambo sa internode. Daghang mga regulator sa cell division plane orientation ang nailhan atol sa paglambo52,53. Ang among trabaho naghatag og klaro nga ehemplo kon giunsa pag-regulate sa kalihokan sa GA signaling kini nga cellular parameter. Ang DELLA mahimong makig-uban sa prefolding protein complexes41, mao nga ang GA signaling mahimong mag-regulate sa orientation sa cell division plane pinaagi sa direktang pag-impluwensya sa cortical microtubule orientation40,41,54,55. Wala damha namong gipakita nga sa SAM, ang correlate sa mas taas nga kalihokan sa GA signaling dili cell elongation o division, apan growth anisotropy lamang, nga nahiuyon sa direktang epekto sa GA sa direksyon sa cell division sa IPR. Bisan pa, dili nato ibaliwala nga kini nga epekto mahimo usab nga dili direkta, pananglitan nga gipaagi sa GA-induced cell wall softening56. Ang mga pagbag-o sa mga kinaiya sa cell wall nag-aghat sa mechanical stress57,58, nga mahimo usab nga makaimpluwensya sa oryentasyon sa cell division plane pinaagi sa pag-apekto sa oryentasyon sa cortical microtubule39,46,59. Ang hiniusa nga mga epekto sa GA-induced mechanical stress ug direktang regulasyon sa microtubule orientation sa GA mahimong nalambigit sa pagmugna og usa ka piho nga sumbanan sa oryentasyon sa cell division sa IPR aron matino ang mga internode, ug dugang nga mga pagtuon ang gikinahanglan aron masulayan kini nga ideya. Sa susama, ang nangaging mga pagtuon nagpasiugda sa kamahinungdanon sa DELLA-interacting proteins nga TCP14 ug 15 sa pagkontrol sa pagporma sa internode60,61 ug kini nga mga hinungdan mahimong magpataliwala sa aksyon sa GA kauban ang BREVIPEDICELLUS (BP) ug PENNYWISE (PNY), nga nag-regulate sa paglambo sa internode ug gipakita nga nakaimpluwensya sa GA signaling2,62. Tungod kay ang mga DELLA nakig-interact sa brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, ug abscisic acid (ABA) signaling pathways63,64 ug nga kini nga mga hormone makaimpluwensya sa microtubule orientation65, ang mga epekto sa GA sa cell division orientation mahimo usab nga tungod sa ubang mga hormone.
Ang mga unang pagtuon sa cytology nagpakita nga ang sulod ug gawas nga mga rehiyon sa Arabidopsis SAM gikinahanglan alang sa paglambo sa internode2,42. Ang kamatuoran nga ang GA aktibo nga nag-regulate sa cell division sa sulod nga mga tisyu12 nagsuporta sa doble nga gimbuhaton sa GA sa pag-regulate sa meristem ug gidak-on sa internode sa SAM. Ang sumbanan sa directional cell division hugot usab nga gi-regulate sa sulod nga tisyu sa SAM, ug kini nga regulasyon hinungdanon alang sa pagtubo sa punoan52. Makapainteres nga susihon kung ang GA adunay usab papel sa pag-orient sa cell division plane sa sulod nga organisasyon sa SAM, sa ingon nag-synchronize sa espesipikasyon ug paglambo sa mga internode sulod sa SAM.
Ang mga tanom gipatubo in vitro sa yuta o 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) nga gisuplementohan og 1% sucrose ug 1% agar (Sigma) ubos sa standard nga mga kondisyon (16 ka oras nga kahayag, 22 °C), gawas sa mga eksperimento sa hypocotyl ug pagtubo sa gamot diin ang mga semilya gipatubo sa bertikal nga mga plato ubos sa kanunay nga kahayag ug 22 °C. Alang sa mga eksperimento sa nitrate, ang mga tanom gipatubo sa giusab nga MS medium (bioWORLD plant medium) nga gisuplementohan og igong nitrate (0 o 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose ug 1% A-agar (Sigma) ubos sa mga kondisyon sa taas nga adlaw.
Ang GID1a cDNA nga gisulod sa pDONR221 gi-recombine uban sa pDONR P4-P1R-pUBQ10 ug pDONR P2R-P3-mCherry ngadto sa pB7m34GW aron makamugna og pUBQ10::GID1a-mCherry. Ang IDD2 DNA nga gisulod sa pDONR221 gi-recombine ngadto sa pB7RWG266 aron makamugna og p35S:IDD2-RFP. Aron makamugna og pGID1b::2xmTQ2-GID1b, usa ka 3.9 kb nga fragment sa ibabaw sa GID1b coding region ug usa ka 4.7 kb nga fragment nga adunay GID1b cDNA (1.3 kb) ug terminator (3.4 kb) ang unang gi-amplify gamit ang mga primer sa Supplementary Table 3 ug dayon gisulod sa pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) ug pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), matag usa, ug sa katapusan gi-recombine uban sa pDONR221 2xmTQ268 ngadto sa pGreen 012567 target vector gamit ang Gateway cloning. Aron makamugna og pCUC2::LSSmOrange, ang CUC2 promoter sequence (3229 bp upstream sa ATG) gisundan sa coding sequence sa dagkong Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 uban sa N7 nuclear localization signal ug ang NOS transcriptional terminator gi-assemble ngadto sa pGreen kanamycin targeting vector gamit ang Gateway 3-fragment recombination system (Invitrogen). Ang plant binary vector gipaila ngadto sa Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 ug gipaila ngadto sa Nicotiana benthamiana leaves pinaagi sa Agrobacterium infiltration method ug ngadto sa Arabidopsis thaliana Col-0 pinaagi sa floral dip method, matag usa. Ang pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ug pCLV3::mCherry-NLS qmRGA gi-isolate gikan sa F3 ug F1 progenies sa tagsa-tagsa ka crosses, matag usa.
Ang RNA in situ hybridization gihimo sa gibana-bana nga 1 cm ang gitas-on nga mga tumoy sa saha72, nga gikolekta ug dayon gi-fix sa solusyon sa FAA (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) nga gipabugnaw sa 4 °C. Human sa 2 × 15 minutos nga vacuum treatments, ang fixative giilisan ug ang mga sample gi-incubate sa tibuok gabii. Ang mga GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, ug RGL3 cDNAs ug mga antisense probes sa ilang 3′-UTRs gi-synthesize gamit ang mga primer nga gipakita sa Supplementary Table 3 sama sa gihulagway ni Rosier et al.73. Ang mga probe nga may label nga Digoxigenin gi-immunodetect gamit ang digoxigenin antibodies (3000-fold dilution; Roche, catalog number: 11 093 274 910), ug ang mga seksyon gi-stain gamit ang 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250-fold dilution)/nitroblue tetrazolium (NBT, 200-fold dilution) solution.