Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS. Para sa labing maayong resulta, among girekomendar nga mogamit ka og mas bag-ong bersyon sa imong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Samtang, aron masiguro ang padayon nga suporta, among gipakita ang site nga walay styling o JavaScript.
Ang pagkadiskobre ug mapuslanong paggamit sa mga natural nga produkto makatabang sa pagpauswag sa kinabuhi sa tawo. Ang mga kemikal nga makapugong sa pagtubo sa tanom kaylap nga gigamit isip mga herbicide aron makontrol ang mga sagbot. Tungod sa panginahanglan sa paggamit sa lain-laing klase sa herbicide, adunay panginahanglan sa pag-ila sa mga compound nga adunay bag-ong mga mekanismo sa aksyon. Niini nga pagtuon, among nadiskobrehan ang usa ka nobela nga N-alkoxypyrrole compound, coumamonamide, gikan sa Streptomyces werraensis MK493-CF1 ug natukod ang kompleto nga proseso sa synthesis. Pinaagi sa mga biological activity assay, among nadiskobrehan nga ang urs-monoamic acid usa ka synthetic intermediate sa urs-monoamide ug usa ka potensyal nga...tigpugong sa pagtubo sa tanomDugang pa, nakahimo kami og lain-laing mga urbenonic acid derivatives, lakip ang urbenyloxy derivative (UDA), nga adunay taas nga herbicidal activity nga wala makaapekto sa pagtubo sa mga HeLa cells. Nakita usab namo nga ang mga urmotonic acid derivatives makabalda sa mga microtubule sa tanom; dugang pa, ang KAND makaapekto sa mga actin filament ug hinungdan sa pagkamatay sa selula; Kini nga mga multifaceted nga epekto lahi sa mga nailhan nga microtubule inhibitors ug nagsugyot og bag-ong mekanismo sa aksyon para sa ursonic acid, nga nagrepresentar sa usa ka importante nga bentaha sa pagpalambo sa bag-ong mga herbicide.
Ang pagkadiskobre ug praktikal nga paggamit sa mapuslanong natural nga mga produkto ug sa ilang mga gigikanan usa ka paagi sa pagpauswag sa kalidad sa kinabuhi sa tawo. Ang mga sekondaryang metabolite nga gihimo sa mga mikroorganismo, tanom ug mga insekto misangpot sa dagkong mga pag-uswag sa medisina ug agrikultura. Daghang mga antibiotic ug mga tambal nga kontra-leukemia ang naugmad gikan sa natural nga mga produkto. Dugang pa, lain-laing mga klase samga pestisidyo, ang mga fungicide ug herbicide gikuha gikan niining natural nga mga produkto para gamiton sa agrikultura. Sa partikular, ang mga herbicide sa pagkontrol sa sagbot importante nga mga himan para sa pagdugang sa abot sa tanom sa modernong agrikultura, ug lain-laing klase sa mga compound ang gigamit na sa komersyo. Daghang proseso sa selula sa mga tanom, sama sa photosynthesis, metabolismo sa amino acid, synthesis sa cell wall, regulasyon sa mitosis, phytohormone signaling, o protein synthesis, giisip nga tipikal nga target sa mga herbicide. Ang mga compound nga nagpugong sa function sa microtubule usa ka komon nga klase sa mga herbicide nga makaapekto sa pagtubo sa tanom pinaagi sa pag-apekto sa mitotic regulation2.
Ang mga microtubule mga sangkap sa cytoskeleton ug kaylap nga gipreserbar sa mga eukaryotic cell. Ang tubulin heterodimer gilangkoban sa α-tubulin ug β-tubulin nga nagporma og linear microtubule protofilaments, nga adunay 13 ka protofilaments nga nagporma og cylindrical nga istruktura. Ang mga microtubule adunay daghang papel sa mga selula sa tanom, lakip ang pagtino sa porma sa selula, pagbahin sa selula, ug intracellular transport3,4. Ang mga selula sa tanom adunay mga microtubule sa ilawom sa interphase plasma membrane, ug kini nga gitawag nga cortical microtubule gituohan nga nagkontrol sa organisasyon sa cellulose microfibrils pinaagi sa regulasyon sa cellulose synthase complexes4,5. Ang mga cortical microtubule sa mga root epidermal cells, nga anaa sa zone sa paspas nga pag-inat sa tumoy sa gamot, nahimutang sa kilid, ug ang mga cellulose microfiber nagsunod niini nga mga microtubule ug naglimite sa direksyon sa pagpalapad sa selula, sa ingon nagpasiugda sa anisotropic cell elongation. Busa, ang function sa microtubule suod nga nalambigit sa morphology sa tanom. Ang mga pag-ilis sa amino acid sa mga gene nga nag-encode sa tubulin hinungdan sa pagkausab sa cortical microtubule arrays ug wala o tuo nga pagtubo sa Arabidopsis 6,7. Sa susama, ang mga mutasyon sa mga protina nga nalangkit sa microtubule nga nag-regulate sa dinamika sa microtubule mahimo usab nga mosangpot sa distorted nga pagtubo sa gamot8,9,10,11,12,13. Dugang pa, ang pagtambal gamit ang mga herbicide nga makabalda sa microtubule sama sa disopyramide, nailhan usab nga pretilachlor, hinungdan usab sa wala nga oblique nga pagtubo sa gamot14. Kini nga datos nagpakita nga ang tukma nga regulasyon sa function sa microtubule hinungdanon alang sa pagtino sa direksyon sa pagtubo sa tanom.
Nagkalain-laing klase sa microtubule inhibitors ang nadiskobrehan, ug kini nga mga tambal nakahatag ug dakong kontribusyon sa panukiduki sa cytoskeletal, ingon man sa agrikultura ug medisina2. Sa partikular, ang oryzalin, dinitroaniline compounds, disopyramide, benzamide-related compounds, ug ang ilang mga analogs makapugong sa function sa microtubule ug sa ingon makapugong sa pagtubo sa tanom. Busa, kini kaylap nga gigamit isip herbicides. Bisan pa, tungod kay ang mga microtubule usa ka importante nga sangkap sa mga selula sa tanom ug hayop, kadaghanan sa mga microtubule inhibitors kay cytotoxic sa duha ka klase sa selula. Busa, bisan pa sa ilang giila nga gamit isip herbicides, limitado nga gidaghanon sa mga antimicrotubule agent ang gigamit alang sa praktikal nga katuyoan.
Ang Streptomyces usa ka genus sa pamilyang Streptomyces, nga naglakip sa aerobic, gram-positive, filamentous bacteria ug nailhan tungod sa abilidad niini sa paghimo og lain-laing mga secondary metabolite. Busa, kini giisip nga usa sa labing importante nga tinubdan sa bag-ong biologically active natural nga mga produkto. Sa kasamtangang pagtuon, among nadiskobrehan ang usa ka bag-ong compound nga gitawag og coumamonamide, nga gi-isolate gikan sa Streptomyces werraensis MK493-CF1 ug S. werraensis ISP 5486. Gamit ang spectral analysis ug full spectral analysis, ang istruktura sa coumamonamide gihulagway ug ang talagsaon nga N-alkoxypyrrole skeleton niini natino. Ang Ursmonic acid, usa ka synthetic intermediate sa ursmonoamide ug sa mga derivatives niini, nakit-an nga nagpugong sa pagtubo ug pagtubo sa sikat nga modelo sa tanom nga Arabidopsis thaliana. Sa usa ka pagtuon sa structure-activity relationship, among nakita nga ang usa ka compound nga adunay C9 nga giusab ngadto sa ursonic acid, nga gitawag og nonyloxy derivative sa ursonic acid (KAND), nagpalambo pag-ayo sa inhibitory effect sa pagtubo ug pagtubo. Ilabi na, ang bag-ong nadiskobrehan nga plant growth inhibitor nakaapekto usab sa pagtubo sa tabako ug liverwort ug dili cytotoxic sa bacteria o HeLa cells. Dugang pa, ang ubang urmotonic acid derivatives nag-induce og distorted root phenotype, nga nagpasabot nga kini nga mga derivatives direkta o dili direkta nga makaapekto sa microtubule. Subay niini nga ideya, ang among mga obserbasyon sa mga microtubule nga gimarkahan og immunohistochemically o fluorescent proteins nagpakita nga ang KAND treatment nag-depolymerize sa mga microtubule. Dugang pa, ang treatment gamit ang kumamotonic acid derivatives nakabalda sa actin microfilaments. Busa, nakadiskubre kami og bag-ong plant growth inhibitor kansang talagsaon nga mekanismo sa aksyon naglakip sa pagguba sa cytoskeleton.
Ang strain nga MK493-CF1 gi-isolate gikan sa yuta sa Shinagawa-ku, Tokyo. Ang strain nga MK493-CF1 nagporma og well-branched stromal mycelium. Ang partial sequence sa 16S ribosomal RNA gene (1422 bp) natino. Kini nga strain susama kaayo sa S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipikal nga strain, 99.93%). Base sa kini nga resulta, natino nga kini nga strain suod nga may kalabutan sa tipo sa strain sa S. werraensis. Busa, among temporaryong ginganlan kini nga strain nga S. werraensis MK493-CF1. Ang S. werraensis ISP 5486T nagpatungha usab sa parehas nga bioactive compounds. Tungod kay gamay ra ang sayo nga panukiduki sa pagkuha sa natural nga mga produkto gikan niini nga microorganism, gihimo ang dugang nga panukiduki sa kemikal. Human sa pagtanom sa S. werraensis MK493-CF1 sa barley medium pinaagi sa solid-state fermentation sa 30°C sulod sa 14 ka adlaw, ang medium gi-extract gamit ang 50% EtOH. 60 ml nga sample ang gipauga aron makakuha og 59.5 mg nga crude extract. Ang crude extract gipailalom sa reverse phase HPLC aron makahatag og N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, ginganlan og coumamonamide, 36.0 mg). Ang kinatibuk-ang kantidad sa 1 gibana-bana nga 60% sa crude extract. Busa, nakahukom kami nga tun-an pag-ayo ang mga kabtangan sa kumamotoamide 1.
Ang Coumamonamide 1 usa ka puti nga amorphous powder ug ang high resolution mass spectrometry (HRESIMS) nagpamatuod sa C6H8N2O2 (Fig. 1). Ang C2-substituted pyrrole fragment niini nga compound gihulagway sa δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH sa 1H NMR spectrum: 4.5 Hz, H-5) ug δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), ug ang 13C NMR spectrum nagpakita sa presensya sa upat ka sp2 carbon atoms. Ang presensya sa usa ka amide group sa C2 nga posisyon gisusi pinaagi sa HMBC correlation gikan sa C-3 proton ngadto sa amide carbonyl carbon sa δC 161.1. Dugang pa, ang 1 H ug 13 C NMR peaks sa δH 4.10 (3H, S) ug δC 68.3 nagpakita sa presensya sa mga N-methoxy group sa molekula. Bisan tuod ang saktong posisyon sa methoxy group wala pa matino gamit ang spectroscopic analysis sama sa enhanced difference spectroscopy ug nuclear Overhauser abbreviation (NOEDF), ang N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide nahimong unang kandidato nga compound.
Aron mahibal-an ang saktong istruktura sa 1, gihimo ang total synthesis (Fig. 2a). Ang pagtambal sa komersyal nga mabatonan nga 2-aminopyridine 2 gamit ang m-CPBA miresulta sa katugbang nga N-oxide 3 sa quantitative yield. Human sa 2-aminoazidation sa 2, ang cyclocondensation reaction nga gihulagway ni Abramovich gihimo sa benzene sa 90°C aron makuha ang gitinguha nga 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 sa gramos. Speed 60% (duha ka yugto). 15,16. Ang methylation ug hydrolysis sa 4 unya naghatag sa 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (gitawag nga "cumotonic acid", 6) sa maayong ani (70%, duha ka lakang). Sa katapusan, ang amidation pinaagi sa acid chloride intermediate 6 gamit ang aqueous ammonia naghatag sa Kumamoto amide 1 sa 98% nga ani. Ang tanan nga spectral data sa synthesized 1 parehas sa isolated 1, mao nga ang istruktura sa 1 natino;
Kinatibuk-ang sintesis ug pag-analisa sa biyolohikal nga kalihokan sa urbenamide ug urbenic acid. (a) Kinatibuk-ang sintesis sa Kumamoto amide. (b) Ang pito ka adlaw nga edad nga wild-type Arabidopsis Columbia (Col) nga mga semilya gipatubo sa Murashige ug Skoog (MS) nga mga plato nga adunay coumamonamide 6 o coumamonamide 1 sa gipakita nga mga konsentrasyon. Scale bar = 1 cm.
Una, among gisusi ang biyolohikal nga mga kalihokan sa urbenamide ug ang mga intermediate niini alang sa ilang abilidad sa pag-modulate sa pagtubo sa tanom. Nagdugang kami og lain-laing konsentrasyon sa ursmonamide 1 o ursmonic acid 6 sa MS agar medium ug gi-culture nga Arabidopsis thaliana seedlings niini nga medium. Kini nga mga assay nagpakita nga ang taas nga konsentrasyon (500 μM) sa 6 nakapugong sa pagtubo sa gamot (Fig. 2b). Sunod, nakamugna kami og lain-laing mga derivatives pinaagi sa pag-ilis sa N1 nga posisyon sa 6 ug nagpahigayon og mga pagtuon sa relasyon sa istruktura-kalihokan niini (ang proseso sa analogue synthesis gihulagway sa Supporting Information (SI)). Ang mga Arabidopsis seedlings gipatubo sa usa ka medium nga adunay 50 μM ursonic acid derivatives, ug gisukod ang gitas-on sa gamot sama sa gipakita sa hulagway. Sama sa gipakita sa Figures 3a, b, ug S1, ang mga coumamo acid adunay lain-laing gitas-on sa linear alkoxy chains (9, 10, 11, 12, ug 13) o dagkong alkoxy chains (15, 16, ug 17) sa N1 nga posisyon. Ang mga derivatives nagpakita og dakong pagpugong sa pagtubo sa gamot. Dugang pa, among nakita nga ang paggamit og 200 μM 10, 11, o 17 nakapugong sa pagtubo (Figs. 3c ug S2).
Pagtuon sa relasyon sa istruktura-kalihokan sa Kumamoto amide ug mga may kalabutan nga compound. (a) Istruktura ug sintesis nga eskema sa mga analogue. (b) Kwantipikasyon sa gitas-on sa gamot sa 7 ka adlaw nga mga semilya nga gipatubo sa MS medium nga adunay o walay 50 μM coumamonamide derivatives. Ang mga asterisk nagpakita sa mga mahinungdanong kalainan sa sham treatment (t test, p< 0.05). n>18. Ang datos gipakita isip mean ± SD. Ang nt nagpasabot nga “wala gisulayan” tungod kay kapin sa 50% sa mga liso ang wala moturok. (c) Pagkwenta sa gikusgon sa pagtubo sa gitambalan nga mga liso nga gi-incubate sulod sa 7 ka adlaw sa MS medium nga adunay o walay 200 μM coumamonamide ug mga may kalabutan nga compound. Ang mga asterisk nagpakita sa mga mahinungdanong kalainan sa sham treatment (chi-square test). n=96.
Makapainteres nga ang pagdugang sa alkyl side chains nga mas taas kay sa C9 nakapakunhod sa inhibitory activity, nga nagsugyot nga ang mga compound nga may kalabutan sa kumamotoic acid nanginahanglan og side chains nga adunay piho nga gidak-on aron ipakita ang ilang biological activity.
Tungod kay ang pag-analisa sa relasyon sa istruktura-kalihokan nagpakita nga ang C9 giusab ngadto sa ursonic acid ug ang nonyloxy derivative sa ursonic acid (dinhi gitawag nga KAND 11) mao ang labing epektibo nga tigpugong sa pagtubo sa tanom, naghimo kami og mas detalyado nga pag-ila sa KAND 11. Ang pagtambal sa Arabidopsis gamit ang 50 μM KAND 11 halos hingpit nga nakapugong sa pagtubo, samtang ang mas ubos nga konsentrasyon (40, 30, 20, o 10 μM) sa KAND 11 nakapugong sa pagtubo sa gamot sa usa ka paagi nga nagdepende sa dosis (Fig. 4a, b). Aron masulayan kung ang KAND 11 makaapekto ba sa viability sa root meristem, among gisusi ang mga root meristem nga gitina gamit ang propidium iodide (PI) ug gisukod ang gidak-on sa meristem area. Ang gidak-on sa meristem sa mga semilya nga gipatubo sa usa ka medium nga adunay 25 μM KAND-11 kay 151.1 ± 32.5 μm, samtang ang gidak-on sa meristem sa mga semilya nga gipatubo sa usa ka control medium nga adunay DMSO kay 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d), nga nagpakita nga ang KAND-11 nagpahiuli sa kalihokan sa selula. pagkaylap. Root meristem. Subay niini, ang pagtambal sa KAND 11 nakakunhod sa gidaghanon sa cell division marker nga CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signal sa root meristem (Fig. 4e) 17. Kini nga mga resulta nagpakita nga ang KAND 11 nagpugong sa pagtubo sa gamot pinaagi sa pagpakunhod sa kalihokan sa pagdaghan sa selula.
Pagtuki sa epekto sa pagpugong sa mga urbenonic acid derivatives (urbenyloxy derivatives) sa pagtubo. (a) 7 ka adlaw nga edad nga wild-type nga mga semilya sa Col nga gipatubo sa mga MS plate nga adunay gipakita nga konsentrasyon sa KAND 11. Scale bar = 1 cm. (b) Pagkwenta sa gitas-on sa gamot. Ang mga letra nagpakita sa mga mahinungdanong kalainan (Tukey HSD test, p< 0.05). n>16. Ang datos gipakita isip mean ± SD. (c) Confocal microscopy sa propidium iodide-stained wild-type Col roots nga gipatubo sa MS plates nga adunay o walay 25 μM KAND 11. Ang puti nga bracket nagpakita sa root meristem. Scale bar = 100 µm. (d) Kwantipikasyon sa gidak-on sa root meristem (n = 10 hangtod 11). Ang mga kalainan sa istatistika gitino gamit ang t-test (p< 0.05). Ang mga bar nagrepresentar sa aberids nga gidak-on sa meristem. (e) Differential interference contrast (DIC) microscopy sa usa ka root meristem nga adunay CDKB2 construct; 1pro: CDKB2; 1-GUS nga gipintalan ug gipintalan sa 5 ka adlaw nga mga semilya nga gipatubo sa MS plates nga adunay o walay 25 µM KAND assay.
Ang phytotoxicity sa KAND 11 dugang gisulayan gamit ang laing dicotyledonous nga tanom, ang tabako (Nicotiana tabacum), ug usa ka mayor nga modelo sa organismo sa tanom sa yuta, ang liverwort (Marchantia polymorpha). Sama sa kaso sa Arabidopsis, ang mga semilya sa tabako SR-1 nga gipatubo sa medium nga adunay 25 μM KAND 11 nagpatunghag mas mubo nga mga gamot (Fig. 5a). Dugang pa, 40 sa 48 ka liso ang miturok sa mga plato nga adunay 200 μM KAND 11, samtang ang tanang 48 ka liso miturok sa mock-treated media, nga nagpakita nga ang mas taas nga konsentrasyon sa KAND kay significant (p< 0.05; chi test -square) nakapugong sa pagtubo sa tabako. (Fig. 5b). Dugang pa, ang konsentrasyon sa KAND 11 nga nakapugong sa pagtubo sa bakterya sa liverwort parehas sa epektibo nga konsentrasyon sa Arabidopsis (Fig. 5c). Kini nga mga resulta nagpakita nga ang KAND 11 makapugong sa pagtubo sa lainlaing mga tanum. Gisusi dayon namo ang posible nga cytotoxicity sa mga compound nga may kalabutan sa bear monoamide sa ubang mga organismo, nga mao ang mga selula sa HeLa sa tawo ug Escherichia coli strain DH5α, isip mga representante sa mas taas nga selula sa hayop ug bakterya, matag usa. Sa usa ka serye sa mga cell proliferation assays, among naobserbahan nga ang coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, ug KAND 11 wala makaapekto sa pagtubo sa mga selula sa HeLa o E. coli sa mga konsentrasyon nga 100 μM (Fig. 5d,e).
Pagpugong sa pagtubo sa KAND 11 sa mga organismo nga dili Arabidopsis. (a) Ang duha ka semana nga edad nga wild-type SR-1 nga mga semilya sa tabako gipatubo sa bertikal nga posisyon nga MS plates nga adunay 25 μM KAND 11. (b) Ang duha ka semana nga edad nga wild-type SR-1 nga mga semilya sa tabako gipatubo sa pinahigda nga posisyon nga MS plates nga adunay 200 μM KAND 11. (c) Ang duha ka semana nga edad nga wild-type Tak-1 liverwort bud nga gipatubo sa Gamborg B5 plates nga adunay gipakita nga konsentrasyon sa KAND 11. Ang pula nga mga pana nagpakita sa mga spore nga mihunong sa pagtubo sulod sa duha ka semana nga panahon sa paglumlom. (d) Cell proliferation assay sa mga selula sa HeLa. Ang gidaghanon sa mabuhi nga mga selula gisukod sa piho nga mga agwat sa oras gamit ang cell counting kit 8 (Dojindo). Isip usa ka kontrol, ang mga selula sa HeLa gitambalan og 5 μg/ml actinomycin D (Act D), nga nagpugong sa RNA polymerase transcription ug hinungdan sa kamatayon sa selula. Ang mga pag-analisar gihimo sa triplicate. (e) E. coli cell proliferation assay. Ang pagtubo sa E. coli gisusi pinaagi sa pagsukod sa OD600. Isip kontrol, ang mga selula gitambalan og 50 μg/ml ampicillin (Amp), nga nagpugong sa sintesis sa bacterial cell wall. Ang mga pag-analisar gihimo sa tulo ka beses.
Aron masabtan ang mekanismo sa aksyon sa cytotoxicity nga gipahinabo sa mga compound nga may kalabutan sa uramide, among gisusi pag-usab ang mga urbenic acid derivatives nga adunay kasarangan nga mga epekto sa pagpugong, sama sa gipakita sa litrato. Sama sa gipakita sa Figures 2b, 6a, ang mga semilya nga gipatubo sa mga agar plate nga adunay taas nga konsentrasyon (200 μM) sa urmotonic acid 6 nagpatunghag mas mubo ug wala nga kurbado nga mga gamot (θ = – 23.7 ± 6.1), samtang sa mga semilya nga gipatubo sa control medium, ang mga semilya nagpatunghag halos tul-id nga mga gamot (θ = – 3.8 ± 7.1). Kini nga kinaiya nga oblique nga pagtubo nahibal-an nga resulta sa dysfunction sa cortical microtubule14,18. Nahiuyon niini nga nadiskobrehan, ang mga tambal nga nagdaot sa microtubule nga disopyramide ug oryzalin nagpahinabo sa parehas nga pagkiling sa gamot ubos sa among mga kondisyon sa pagtubo (Figs. 2b, 6a). Sa parehas nga oras, among gisulayan ang mga urmotonic acid derivatives ug gipili ang pipila niini nga, sa pipila ka konsentrasyon, nagpahinabo sa oblique nga pagtubo sa gamot. Ang mga compound 8, 9, ug 15 nag-usab sa direksyon sa pagtubo sa gamot sa 75 μM, 50 μM, ug 40 μM, matag usa, nga nagpakita nga kini nga mga compound epektibo nga maka-destabilize sa mga microtubule (Fig. 2b, 6a). Gisulayan usab namo ang labing kusgan nga ursolic acid derivative, ang KAND 11, sa mas ubos nga konsentrasyon (15 µM) ug nakit-an nga ang paggamit sa KAND 11 nakapugong sa pagtubo sa gamot ug nga ang direksyon sa pagtubo sa gamot dili patas, bisan kung kini lagmit nga mo-slope sa wala (Figure C3). . Tungod kay ang mas taas nga konsentrasyon sa mga tambal nga maka-destabilize sa microtubule usahay makababag sa pagtubo sa tanom imbes nga hinungdan sa pagkiling sa gamot, among gisusi ang posibilidad nga ang KAND 11 makaapekto sa mga microtubule pinaagi sa pag-obserbar sa mga cortical microtubule sa mga root epidermal cells. Ang immunohistochemistry gamit ang anti-β-tubulin antibodies sa mga epidermal cells sa mga gamot sa seedling nga gitambalan og 25 μM KAND 11 nagpakita sa pagkawala sa halos tanan nga cortical microtubule sa mga epidermal cells sa elongation zone (Fig. 6b). Kini nga mga resulta nagpakita nga ang kumamotonic acid ug ang mga gigikanan niini direktang molihok o dili direkta sa mga microtubule aron mabalda kini ug nga kini nga mga compound mga bag-ong microtubule inhibitor.
Ang Ursonic acid ug ang mga derivatives niini nag-usab sa cortical microtubule sa Arabidopsis thaliana. (a) Anggulo sa pagkahilig sa gamot nga gisukod sa presensya sa lainlaing mga urmotonic acid derivatives sa gipakita nga mga konsentrasyon. Gisusi usab ang mga epekto sa duha ka compound nga nahibal-an nga nagpugong sa mga microtubule: disopyramide ug oryzalin. Gipakita sa inset ang sumbanan nga gigamit sa pagsukod sa anggulo sa pagtubo sa gamot. Ang mga asterisk nagpakita sa hinungdanon nga mga kalainan sa sham treatment (t test, p< 0.05). n>19. Scale bar = 1 cm. (b) Cortical microtubule sa epidermal cells sa elongation zone. Ang mga microtubule sa wild-type Arabidopsis Col roots nga gipatubo sa MS plates nga adunay o walay 25 μM KAND 11 gi-visualize pinaagi sa immunohistochemical staining gamit ang β-tubulin primary antibodies ug Alexa Fluor-conjugated secondary antibodies. Scale bar = 10 µm. (c) Mitotic structure sa mga microtubule sa root meristem. Ang mga microtubule gi-visualize gamit ang immunohistochemical staining. Ang mga mitotic structure, lakip ang mga prophase zone, spindle, ug phragmoplast, giihap gikan sa mga confocal image. Ang mga pana nagpakita sa mga mitotic microtubule structure. Ang mga asterisk nagpakita sa mga significant differences sa sham treatment (t test, p< 0.05). n>9. Bar sa sukdanan = 50 µm.
Bisan tuod ang Ursa adunay abilidad sa pagguba sa function sa microtubule, ang mekanismo sa aksyon niini gilauman nga lahi sa tipikal nga microtubule depolymerizing agents. Pananglitan, ang mas taas nga konsentrasyon sa microtubule depolymerizing agents sama sa disopyramide ug oryzalin nag-induce sa anisotropic expansion sa epidermal cells, samtang ang KAND 11 wala. Dugang pa, ang co-application sa KAND 11 ug disopyramide miresulta sa usa ka hiniusa nga disopyramide-induced root growth response ug ang KAND 11-induced growth inhibition naobserbahan (Fig. S4). Gisusi usab namo ang tubag sa hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant sa KAND 11. Ang phs1-1 adunay non-canonical tubulin kinase point mutation ug nagpatunghag mas mubo nga mga gamot kung gitambalan gamit ang disopyramide9,20. Ang phs1-1 mutant seedlings nga gipatubo sa agar medium nga adunay KAND 11 adunay mas mubo nga mga gamot nga susama sa gipatubo sa disopyramid (fig. S5).
Dugang pa, among naobserbahan ang mga istruktura sa mitotic microtubule, sama sa mga prophase zone, spindle, ug phragmoplast, sa root meristem sa mga semilya nga gitambalan og KAND 11. Subay sa mga obserbasyon para sa CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, usa ka dakong pagkunhod sa gidaghanon sa mga mitotic microtubule ang naobserbahan (Fig. .6c).
Aron mailhan ang cytotoxicity sa KAND 11 sa subcellular resolution, among gitambalan ang mga tobacco BY-2 suspension cells gamit ang KAND 11 ug giobserbahan ang ilang tubag. Una namong gidugang ang KAND 11 sa mga BY-2 cells nga nagpahayag sa TagRFP-TUA6, nga fluorescently nag-label sa mga microtubule, aron masusi ang epekto sa KAND 11 sa cortical microtubule. Ang cortical microtubule density gisusi gamit ang image analysis, nga nag-quantify sa porsyento sa cytoskeletal pixels taliwala sa cytoplasmic pixels. Ang mga resulta sa assay nagpakita nga human sa pagtambal gamit ang 50 μM o 100 μM KAND 11 sulod sa 1 ka oras, ang density mikunhod pag-ayo ngadto sa 0.94 ± 0.74% o 0.23 ± 0.28%, matag usa, samtang ang density sa mga cells nga gitambalan gamit ang DMSO, mikabat sa 1.61 ± 0.34% (Fig. 7a). Kini nga mga resulta nahiuyon sa obserbasyon sa Arabidopsis nga ang pagtambal sa KAND 11 nag-induce sa depolymerization sa cortical microtubule (Fig. 6b). Gisusi usab namo ang BY-2 line nga adunay GFP-ABD-labeled actin filaments human sa pagtambal gamit ang parehas nga konsentrasyon sa KAND 11 ug naobserbahan nga ang pagtambal sa KAND 11 nakabalda sa mga actin filaments. Ang pagtambal gamit ang 50 μM o 100 μM KAND 11 sulod sa 1 ka oras mikunhod pag-ayo sa densidad sa actin filament ngadto sa 1.20 ± 0.62% o 0.61 ± 0.26%, matag usa, samtang ang densidad sa mga selula nga gitambalan sa DMSO kay 1.69 ± 0.51% (Fig. 2). 7b). Kini nga mga resulta sukwahi sa mga epekto sa propyzamide, nga wala makaapekto sa mga actin filaments, ug latrunculin B, usa ka actin depolymerizer nga wala makaapekto sa mga microtubule (SI Figure S6). Dugang pa, ang pagtambal gamit ang coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, o KAND 11 wala makaapekto sa mga microtubule sa mga selula sa HeLa (SI Figure S7). Busa, ang mekanismo sa aksyon sa KAND 11 gituohan nga lahi sa nailhan nga mga cytoskeleton disruptor. Dugang pa, ang among mikroskopikong obserbasyon sa mga BY-2 cells nga gitambalan gamit ang KAND 11 nagpadayag sa pagsugod sa pagkamatay sa cell atol sa pagtambal sa KAND 11 ug nagpakita nga ang proporsyon sa mga patay nga selula nga adunay blue-stained nga Evans wala kaayo misaka human sa 30 minutos nga pagtambal sa KAND 11, samtang human sa 90 minutos nga pagtambal gamit ang 50 μM o 100 μM KAND, ang gidaghanon sa mga patay nga selula misaka ngadto sa 43.7% o 80.1%, matag usa (Fig. 7c). Kung tan-awon sa kinatibuk-an, kini nga datos nagpakita nga ang nobela nga ursolic acid derivative nga KAND 11 usa ka plant-specific cytoskeletal inhibitor nga adunay wala pa mailhi nga mekanismo sa aksyon.
Ang KAND makaapekto sa cortical microtubule, actin filaments, ug viability sa mga BY-2 cells sa tabako. (a) Pagtan-aw sa cortical microtubule sa mga BY-2 cells sa presensya sa TagRFP-TUA6. Ang mga BY-2 cells nga gitambalan og KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO gisusi pinaagi sa confocal microscopy. Ang cortical microtubule density gikalkulo gikan sa mga micrograph sa 25 ka independente nga mga cells. Ang mga letra nagpakita sa mga mahinungdanong kalainan (Tukey HSD test, p< 0.05). Scale bar = 10 µm. (b) Ang mga cortical actin filament sa BY-2 cells gi-visualize sa presensya sa GFP-ABD2. Ang mga BY-2 cells nga gitambalan og KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO gisusi pinaagi sa confocal microscopy. Ang densidad sa cortical actin filament gikalkulo gikan sa mga micrograph sa 25 ka independente nga mga cell. Ang mga letra nagpakita sa mga mahinungdanong kalainan (Tukey HSD test, p< 0.05). Scale bar = 10 µm. (c) Pag-obserba sa patay nga mga selula sa BY-2 pinaagi sa Evans blue staining. Ang mga selula sa BY-2 nga gitambalan og KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO gisusi pinaagi sa bright-field microscopy. n=3. Scale bar = 100 µm.
Ang pagkadiskobre ug paggamit sa bag-ong natural nga mga produkto misangpot sa dakong mga pag-uswag sa nagkalain-laing aspeto sa kinabuhi sa tawo, lakip na ang medisina ug agrikultura. Gihimo ang makasaysayanong panukiduki aron makakuha og mapuslanong mga compound gikan sa natural nga mga kahinguhaan. Sa partikular, ang mga actinomycetes nailhan nga mapuslanon isip antiparasitic antibiotics para sa mga nematode tungod sa ilang abilidad sa paghimo og lain-laing mga secondary metabolites sama sa avermectin, ang lead compound sa ivermectin ug bleomycin ug mga derivatives niini, nga gigamit sa medisina isip anticancer agent21,22. Ingon man usab, lain-laing mga herbicidal compounds ang nadiskobrehan gikan sa mga actinomycetes, ang uban niini gigamit na sa komersyo1,23. Busa, ang pag-analisar sa mga metabolite sa actinomycete aron ihimulag ang mga natural nga produkto nga adunay gitinguha nga mga kalihokan sa biyolohikal giisip nga usa ka epektibo nga estratehiya. Niini nga pagtuon, among nadiskobrehan ang usa ka bag-ong compound, ang coumamonamide, gikan sa S. werraensis ug malampuson nga gi-synthesize kini. Ang Ursonic acid usa ka synthetic intermediate sa urbenamide ug mga derivatives niini. Mahimo kini nga hinungdan sa kinaiya nga pagkulot sa gamot, magpakita sa kasarangan ngadto sa kusog nga kalihokan sa herbicidal, ug direkta o dili direkta nga makadaot sa mga microtubule sa tanom. Apan, ang mekanismo sa aksyon sa urmotonic acid mahimong lahi sa kasamtangang microtubule inhibitors, tungod kay ang KAND 11 makabalda usab sa mga actin filament ug hinungdan sa kamatayon sa cell, nga nagsugyot og usa ka regulatory mechanism diin ang urmotonic acid ug ang mga derivatives niini makaimpluwensya sa lain-laing mga cytoskeletal structures.
Ang dugang detalyado nga pag-ila sa urbenonic acid makatabang aron mas masabtan ang mekanismo sa aksyon sa urbenonic acid. Sa partikular, ang sunod nga tumong mao ang pagtimbang-timbang sa abilidad sa ursonic acid sa paggapos sa gipakunhod nga microtubule aron mahibal-an kung ang ursonic acid ug ang mga derivatives niini direktang molihok sa mga microtubule ug i-depolymerize kini, o kung ang ilang aksyon moresulta sa destabilization sa microtubule. Dugang pa, sa kaso diin ang mga microtubule dili direktang target, ang pag-ila sa lugar sa aksyon ug mga target sa molekula sa ursonic acid sa mga selula sa tanom makatabang sa dugang nga pagsabot sa mga kabtangan sa mga may kalabutan nga compound ug posible nga mga paagi aron mapauswag ang kalihokan sa herbicidal. Ang among bioactivity assay nagpadayag sa talagsaon nga cytotoxic nga abilidad sa ursonic acid sa pagtubo sa mga tanom sama sa Arabidopsis thaliana, tabako ug liverwort, samtang wala’y E. coli o HeLa cells ang naapektuhan. Gamay o walay toxicity sa mga selula sa hayop ang usa ka bentaha sa mga ursonic acid derivatives kung kini gihimo isip mga herbicide para gamiton sa bukas nga mga umahan sa agrikultura. Sa tinuud, tungod kay ang mga microtubule komon nga mga istruktura sa mga eukaryote, ang ilang selective inhibition sa mga tanom usa ka hinungdanon nga kinahanglanon alang sa mga herbicide. Pananglitan, ang propyzamide, usa ka microtubule depolymerizing agent nga direktang motapot sa tubulin ug makapugong sa polymerization, gigamit isip herbicide tungod sa ubos nga toxicity niini sa mga selula sa hayop24. Sukwahi sa disopyramide, ang mga may kalabutan nga benzamide adunay lain-laing target specificities. Gawas pa sa mga microtubule sa tanom, ang RH-4032 o benzoxamide nagpugong usab sa mga microtubule sa mga selula sa hayop o oomycetes, matag usa, ug ang zalilamide gigamit isip fungicide tungod sa ubos nga phytotoxicity niini25,26,27. Ang bag-ong nadiskobrehan nga oso ug ang mga derivatives niini nagpakita og selective cytotoxicity batok sa mga tanom, apan angayng matikdan nga ang dugang nga mga pagbag-o mahimong makausab sa ilang target specificity, nga posibleng makahatag og dugang nga mga derivatives alang sa pagkontrol sa mga pathogenic fungi o oomycetes.
Ang talagsaon nga mga kabtangan sa urbenonic acid ug mga gigikanan niini mapuslanon alang sa ilang pag-uswag isip mga herbicide ug paggamit isip mga himan sa panukiduki. Ang kahinungdanon sa cytoskeleton sa pagkontrol sa porma sa selula sa tanom kay kaylap nga giila. Ang mga naunang pagtuon nagpakita nga ang mga tanom nakaugmad og komplikado nga mga mekanismo sa organisasyon sa cortical microtubule pinaagi sa pagkontrol sa dinamika sa microtubule aron makontrol sa husto ang morphogenesis. Daghang mga molekula nga responsable sa regulasyon sa kalihokan sa microtubule ang nailhan, ug ang may kalabutan nga panukiduki nagpadayon pa3,4,28. Ang atong kasamtangang pagsabot sa dinamika sa microtubule sa mga selula sa tanom wala hingpit nga nagpatin-aw sa mga mekanismo sa organisasyon sa cortical microtubule. Pananglitan, bisan kung ang disopyramide ug oryzalin parehong maka-depolymerize sa mga microtubule, ang disopyramide hinungdan sa grabe nga pagtuis sa gamot samtang ang oryzalin adunay medyo malumo nga epekto. Dugang pa, ang mga mutasyon sa tubulin, nga nagpalig-on sa mga microtubule, hinungdan usab sa dextrorotation sa mga gamot, samtang ang paclitaxel, nga nagpalig-on usab sa dinamika sa microtubule, wala. Busa, ang pagtuon ug pag-ila sa mga target sa molekula sa ursolic acid kinahanglan maghatag bag-ong mga panabut sa regulasyon sa cortical microtubule sa tanom. Maingon man usab, ang umaabot nga mga pagtandi sa mga kemikal nga epektibo sa pagpasiugda sa hiwi nga pagtubo, sama sa disopyramide, ug dili kaayo epektibo nga mga kemikal, sama sa oryzalin o kumamotoric acid, maghatag og mga timailhan kon giunsa mahitabo ang hiwi nga pagtubo.
Sa laing bahin, ang mga pag-usab-usab sa cytoskeletal nga may kalabutan sa depensa usa pa ka posibilidad nga makapasabut sa cytotoxicity sa ursonic acid. Ang impeksyon sa usa ka pathogen o pagpaila sa usa ka elicitor sa mga selula sa tanom usahay hinungdan sa pagkaguba sa cytoskeleton ug sunod nga pagkamatay sa selula29. Pananglitan, ang cryptoxanthin nga gikan sa oomycete gitaho nga makabalda sa mga microtubule ug actin filament sa wala pa mamatay ang selula sa tabako, susama sa nahitabo sa pagtambal sa KAND30,31. Ang mga pagkaparehas tali sa mga tubag sa depensa ug mga tubag sa selula nga gipahinabo sa ursonic acid nagdala kanamo sa pag-hypothesize nga kini ang hinungdan sa komon nga mga proseso sa selula, bisan kung ang usa ka mas paspas ug mas kusog nga epekto sa ursonic acid kaysa cryptoxanthin klaro. Bisan pa, gipakita sa mga pagtuon nga ang pagkaguba sa mga filament sa actin nagpasiugda sa kusang pagkamatay sa selula, nga dili kanunay nga giubanan sa pagkaguba sa microtubule29. Dugang pa, kinahanglan pa nga makita kung ang pathogen o elicitor hinungdan sa pagtuis sa pagtubo sa gamot, sama sa gibuhat sa mga ursonic acid derivatives. Busa, ang kahibalo sa molekula nga nagkonektar sa mga tubag sa depensa ug sa cytoskeleton usa ka madanihon nga problema nga sulbaron. Pinaagi sa pagpahimulos sa presensya sa mga low molecular weight compound nga may kalabotan sa ursonic acid, ingon man usab sa lainlaing mga derivatives nga adunay lainlaing mga potensyal, mahimo kini maghatag mga oportunidad sa pag-target sa wala mailhi nga mga mekanismo sa selula.
Kon tan-awon sa kinatibuk-an, ang pagdiskobre ug paggamit sa bag-ong mga compound nga nag-modulate sa microtubule dynamics maghatag ug gamhanang mga pamaagi aron matubag ang komplikado nga mga mekanismo sa molekula nga nagpahipi sa pagtino sa porma sa selula sa tanom. Niini nga konteksto, ang bag-o lang naugmad nga compound nga urmotonic acid, nga makaapekto sa microtubule ug actin filaments ug hinungdan sa pagkamatay sa selula, mahimong maghatag ug oportunidad sa pagsabot sa koneksyon tali sa pagkontrol sa microtubule ug niining ubang mga mekanismo. Busa, ang kemikal ug biyolohikal nga pag-analisar gamit ang urbenonic acid makatabang kanato nga masabtan ang mga mekanismo sa regulasyon sa molekula nga nagkontrol sa cytoskeleton sa tanom.
I-inoculate ang S. werraensis MK493-CF1 ngadto sa 500 mL nga baffled Erlenmeyer flask nga adunay sulod nga 110 mL nga seed medium nga gilangkoban sa 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) Bacto composition. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) corn extract (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 ug 0.2% CaCO3 sa deionized nga tubig. (pH 7.4 sa dili pa ang isterilisasyon). Ang mga seed culture gi-incubate sa rotary shaker (180 rpm) sa 27°C sulod sa 2 ka adlaw. Ang produksiyon sa pag-cultivate pinaagi sa solid state fermentation. Ang seed culture (7 ml) gibalhin ngadto sa usa ka 500 ml nga K-1 flask nga adunay sulod nga 40 g nga production medium nga gilangkoban sa 15 g nga pressed barley (MUSO Co., Ltd., Japan) ug 25 g nga deionized water (ang pH wala gi-adjust sa dili pa ang sterilization). Ang fermentation gihimo sa 30°C sa kangitngit sulod sa 14 ka adlaw. Ang fermentation material gi-extract gamit ang 40 ml/botelya nga EtOH ug gi-centrifuge (1500 g, 4°C, 10 min). Ang culture supernatant (60 ml) gi-extract gamit ang sagol nga 10% MeOH/EtOAc. Ang organikong lut-od gipaalisngaw ubos sa gipakunhod nga presyur aron makakuha og residue (59.5 mg), nga gipailalom sa HPLC nga adunay gradient elution (0–10 minutos: 90%) sa usa ka reverse phase column (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × gitas-on 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutos: 90% H2O/CH3CN ngadto sa 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minutos: 90% H2O/EtOH, 45–155 minutos: 90% H2O/EtOH ngadto sa 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) sa flow rate nga 1.5 ml/min, ang coumamonamide (1, 36.0 mg) gi-isolate isip usa ka puti nga amorphous powder.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ gikalkulo nga bili: 141.0659, gisukod nga bili: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Ang mga liso sa Columbia (Col-0) nakuha gikan sa Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) nga adunay pagtugot alang sa paggamit sa panukiduki. Ang mga liso sa Col-0 gipasanay ug gimentinar ubos sa among mga kondisyon sa laboratoryo ug gigamit isip wild-type nga mga tanom nga Arabidopsis. Ang mga liso sa Arabidopsis gi-sterilize sa ibabaw ug gipatubo sa tunga nga kusog nga Murashige ug Skoog medium nga adunay 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) ug 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, sa 23 °C ug kanunay nga kahayag. Ang mga liso sa phs1-1 mutant gihatag ni T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Ang mga liso sa strain SR-1 gihatag sa T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) ug gigamit isip wild-type nga mga tanom nga tabako. Ang mga liso sa tabako gi-sterilize sa ibabaw ug gihumol sa sterile nga tubig sulod sa tulo ka gabii aron mapadali ang pagtubo, dayon gibutang sa usa ka half-strength nga solusyon nga adunay 2% sucrose, 0.05% (w/v) MES, ug 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. ug Skoog medium) nga adunay pH 5.7 ug gi-incubate sa 23°C ubos sa kanunay nga kahayag.
Ang strain nga Tak-1 gihatag sa T. Kohchi (Kyoto University) ug gigamit isip standard experimental unit para sa pagtuon sa liverwort. Ang Gemma nakuha gikan sa isterilisadong gitanom nga mga tanom ug dayon gibutang sa Gamborg B5 medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) nga adunay 1% sucrose ug 0.3% gellan gum ug gi-incubate sa 23°C ubos sa padayon nga kahayag.
Ang mga selula sa Tobacco BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) gihatag ni S. Hasezawa (University of Tokyo). Ang mga selula sa BY-2 gi-dilute og 95 ka pilo sa giusab nga Linsmeier ug Skoog medium ug gidugangan kada semana og 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32. Ang cell suspension gisagol sa rotary shaker sa 130 rpm sa 27°C sa ngitngit. Hugasi ang mga selula gamit ang 10 ka pilo nga gidaghanon sa presko nga medium ug i-resuspend sa parehas nga medium. Ang mga linya sa transgenic cell sa BY-2 nga lig-on nga nagpahayag sa microtubule marker nga TagRFP-TUA6 o ang actin filament marker nga GFP-ABD2 ubos sa cauliflower mosaic virus 35S promoter gihimo sama sa gihulagway 33,34,35. Kini nga mga linya sa cell mahimong mapadayon ug ma-synchronize gamit ang mga pamaagi nga parehas sa gigamit alang sa orihinal nga linya sa cell sa BY-2.
Ang mga selula sa HeLa gikultura sa Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) nga gisuplementohan og 10% fetal bovine serum, 1.2 U/ml penicillin, ug 1.2 μg/ml streptomycin sa usa ka 37°C incubator nga adunay 5% CO2.
Ang tanan nga mga eksperimento nga gihulagway niini nga manuskrito gihimo subay sa mga regulasyon ug giya sa biosafety sa Hapon.
Ang mga compound gitunaw sa dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) isip stock solutions ug gi-dilute sa MS medium para sa Arabidopsis ug tabako o Gamborg B5 medium para sa liverwort. Para sa root growth inhibition assay, sobra sa 10 ka liso kada plato ang gipugas sa agar medium nga adunay gipakita nga mga compound o DMSO. Ang mga liso gi-incubate sa usa ka growth chamber sulod sa 7 ka adlaw. Ang mga seedling gikuhaan og litrato ug gisukod ang gitas-on sa mga gamot. Para sa Arabidopsis germination assay, 48 ka liso kada plato ang gipugas sa agar medium nga adunay 200 μM compound o DMSO. Ang mga liso sa Arabidopsis gipatubo sa usa ka growth chamber ug ang gidaghanon sa miturok nga mga seedling giihap 7 ka adlaw human sa pagtubo (dag). Para sa tobacco germination assay, 24 ka liso kada plato ang gipugas sa agar medium nga adunay 200 μM KAND o DMSO. Ang mga liso sa tabako gipatubo sa usa ka growth chamber ug ang gidaghanon sa miturok nga mga seedling giihap human sa 14 ka adlaw. Para sa liverwort growth inhibition assay, 9 ka embryo gikan sa matag plate ang gibutang sa agar medium nga adunay gipakita nga konsentrasyon sa KAND o DMSO ug gi-incubate sa usa ka growth chamber sulod sa 14 ka adlaw.
Gamita ang mga semilya nga gitinahan og 5 mg/ml propidium iodide (PI) aron makita ang organisasyon sa meristem sa gamot. Ang mga signal sa PI giobserbahan pinaagi sa fluorescence microscopy gamit ang TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems).
Ang histochemical staining sa mga gamot gamit ang β-glucuronidase (GUS) gihimo sumala sa protocol nga gihulagway ni Malami ug Benfey36. Ang mga semilya gi-fix sa 90% acetone sa tibuok gabii, gi-stain gamit ang 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid sa GUS buffer sulod sa 1 ka oras ug gibutang sa hydrated chloraldehyde solution (8 g chloral hydrate, 2 ml nga tubig ug 1 ml glycerol) ug giobserbahan pinaagi sa differential interference contrast microscopy gamit ang Axio Imager M1 microscope (Carl Zeiss).
Ang mga anggulo sa gamot gisukod sa 7 ka adlaw nga edad nga mga semilya nga gipatubo sa mga plato nga gibutang nga patindog. Sukda ang anggulo sa gamot gikan sa direksyon sa gravity vector sama sa gihulagway sa lakang 6.
Ang pagkahan-ay sa mga cortical microtubule naobserbahan sama sa gihulagway, nga adunay gagmay nga mga pagbag-o sa protocol 37. Ang anti-β-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ug Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) gigamit isip panguna ug sekondaryang mga antibody sa 1:1000 ug 1:100 nga mga dilution, matag usa. Ang mga imahe sa fluorescence nakuha gamit ang TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems). Pagkuha og mga imahe sa Z-stack ug paghimo og labing taas nga intensity projection sumala sa mga instruksyon sa tiggama.
Ang HeLa cell proliferation assay gihimo gamit ang Cell Counting Kit 8 (Dojindo) sumala sa mga instruksyon sa tiggama.
Ang pagtubo sa E. coli DH5α gisusi pinaagi sa pagsukod sa densidad sa selula sa kultura gamit ang spectrophotometer sa 600 nm (OD600).
Ang organisasyon sa cytoskeletal sa mga transgenic BY-2 cells naobserbahan gamit ang fluorescence microscope nga adunay CSU-X1 confocal scanning device (Yokogawa) ug sCMOS camera (Zyla, Andor Technology). Ang densidad sa cytoskeletal gisusi pinaagi sa image analysis, nga nag-ihap sa porsyento sa cytoskeletal pixels taliwala sa cytoplasmic pixels sa confocal images gamit ang ImageJ software sama sa gihulagway38,39.
Aron mamatikdan ang kamatayon sa selula sa mga selula sa BY-2, ang usa ka aliquot sa suspensyon sa selula gi-incubate sa 0.05% Evans blue sulod sa 10 ka minuto sa temperatura sa kwarto. Ang piniling pagtina sa Evans blue sa mga patay nga selula nagdepende sa pagpagawas sa tina gikan sa buhing mga selula pinaagi sa wala madaot nga plasma membrane40. Ang mga gitina nga selula giobserbahan gamit ang bright-field microscope (BX53, Olympus).
Ang mga selula sa HeLa gipatubo sa DMEM nga gisuplementohan og 10% FBS sa usa ka humidified incubator sa 37°C ug 5% CO2. Ang mga selula gitambalan og 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), o 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) sulod sa 6 ka oras sa 37°C. Ang mga selula gi-fix gamit ang MetOH sulod sa 10 ka minuto ug dayon gamit ang acetate sulod sa 5 ka minuto sa temperatura sa kwarto. Ang mga gi-fix nga selula gi-incubate gamit ang β-tubulin primary antibody (1D4A4, Proteintech: 66240-1) nga gi-dilute sa 0.5% BSA/PBS sulod sa 2 ka oras, gihugasan og 3 ka beses gamit ang TBST, ug dayon gi-incubate gamit ang Alexa Fluor goat antibody. 488 sulod sa 1 ka oras. – IgG sa ilaga (Thermo Fisher Scientific: A11001) ug 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nga gisagol sa 0.5% BSA/PBS. Human sa paghugas gamit ang TBST sa tulo ka beses, ang mga stained cells giobserbahan sa usa ka Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope. Ang mga imahe nakuha gamit ang usa ka gipabugnaw nga Hamamatsu ORCA-R2 CCD camera gamit ang MetaMorph software (Molecular Devices).
Oras sa pag-post: Hunyo-17-2024