Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS.Alang sa labing maayo nga mga resulta, among girekomendar nga mogamit ka og mas bag-ong bersyon sa imong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Sa kasamtangan, aron masiguro ang padayon nga suporta, gipakita namon ang site nga wala’y istilo o JavaScript.
Ang pagkadiskobre ug mapuslanon nga paggamit sa natural nga mga produkto makatabang sa pagpalambo sa kinabuhi sa tawo.Ang mga kemikal nga makapugong sa pagtubo sa tanum kaylap nga gigamit isip mga herbicide aron makontrol ang mga sagbot.Tungod sa panginahanglan sa paggamit sa lain-laing mga matang sa herbicides, adunay usa ka panginahanglan sa pag-ila sa mga compounds uban sa bag-ong mga mekanismo sa aksyon.Niini nga pagtuon, among nadiskobrehan ang usa ka nobela nga N -alkoxypyrrole compound, coumamonamide, gikan sa Streptomyces werraensis MK493-CF1 ug gitukod ang kompleto nga proseso sa synthesis.Pinaagi sa biological activity assays, among nadiskobrehan nga ang urs-monoamic acid usa ka sintetikong intermediate sa urs-monoamide ug usa ka potensyal.tigpugong sa pagtubo sa tanom.Dugang pa, nakahimo kami og nagkalain-laing urbenonic acid derivatives, lakip ang urbenyloxy derivative (UDA), nga adunay taas nga herbicidal nga kalihokan nga walay negatibong epekto sa pagtubo sa HeLa cells.Among nakita usab nga ang urmotonic acid derivatives makabalda sa mga microtubule sa tanom;Dugang pa, ang KAND nakaapekto sa mga filament sa actin ug nagpahinabo sa pagkamatay sa cell;Kini nga mga multifaceted nga epekto lahi sa mga nahibal-an nga microtubule inhibitors ug nagsugyot og bag-ong mekanismo sa aksyon alang sa ursonic acid, nga nagrepresentar sa usa ka importante nga bentaha sa pagpalambo sa bag-ong mga herbicide.
Ang pagkadiskobre ug praktikal nga paggamit sa mga mapuslanon nga natural nga mga produkto ug ang ilang mga gigikanan usa ka paagi sa pagpauswag sa kalidad sa kinabuhi sa tawo.Ang mga sekundaryong metabolite nga gihimo sa mga mikroorganismo, tanum ug mga insekto nagdala sa dagkong pag-uswag sa medisina ug agrikultura.Daghang antibiotics ug anti-leukemia nga tambal ang naugmad gikan sa natural nga mga produkto.Dugang pa, lain-laing mga matang samga pestisidyo, fungicides ug herbicides gikuha gikan niining natural nga mga produkto para gamiton sa agrikultura.Sa partikular, ang mga herbicide sa pagpugong sa sagbot usa ka importante nga himan alang sa pagdugang sa abot sa ani sa modernong agrikultura, ug ang nagkalain-laing klase sa compound gigamit na sa komersyo.Daghang proseso sa selula sa mga tanom, sama sa photosynthesis, metabolismo sa amino acid, cell wall synthesis, regulasyon sa mitosis, phytohormone signaling, o protina synthesis, gikonsiderar nga tipikal nga target sa mga herbicide.Ang mga compound nga nagpugong sa microtubule function usa ka sagad nga klase sa herbicide nga makaapekto sa pagtubo sa tanum pinaagi sa pag-apekto sa mitotic regulation2.
Ang mga microtubule mga sangkap sa cytoskeleton ug kaylap nga gitipigan sa mga eukaryotic cell.Ang tubulin heterodimer naglangkob sa α-tubulin ug β-tubulin nga nagporma og linear microtubule protofilaments, nga adunay 13 ka protofilament nga nagporma og cylindrical nga istruktura.Ang mga microtubule adunay daghang papel sa mga selula sa tanum, lakip ang pagtino sa porma sa selula, pagbahin sa selula, ug intracellular transport3,4.Ang mga selula sa tanum adunay microtubule sa ilawom sa interphase plasma membrane, ug kini nga gitawag nga cortical microtubules gituohan nga nagkontrol sa organisasyon sa cellulose microfibrils pinaagi sa regulasyon sa cellulose synthase complexes4,5.Ang mga cortical microtubules sa root epidermal cells, nga anaa sa zone sa paspas nga elongation sa root tip, nahimutang sa lateral, ug ang cellulose microfibers nagsunod niini nga mga microtubule ug gilimitahan ang direksyon sa pagpalapad sa selula, sa ingon nagpasiugda sa anisotropic cell elongation.Busa, ang microtubule function suod nga nalangkit sa morpolohiya sa tanom.Ang mga pag-ilis sa amino acid sa mga gene nga nag-encode sa tubulin hinungdan sa skew sa cortical microtubule arrays ug wala o tuo nga kilid nga pagtubo sa Arabidopsis 6,7.Sa susama, ang mutation sa microtubule-associated proteins nga nag-regulate sa microtubule dynamics mahimo usab nga mosangpot sa pagtuis nga pagtubo sa ugat8,9,10,11,12,13.Dugang pa, ang pagtambal sa microtubule-disrupting herbicides sama sa disopyramide, nailhan usab nga pretilachlor, hinungdan usab sa wala nga kilid nga oblique root growth14.Kini nga mga datos nagpakita nga ang tukma nga regulasyon sa microtubule function hinungdanon alang sa pagtino sa direksyon sa pagtubo sa tanum.
Lainlaing klase sa microtubule inhibitors ang nadiskobrehan, ug kini nga mga tambal nakahatag ug dakong kontribusyon sa cytoskeletal research, ingon man sa agrikultura ug medisina2.Sa partikular, ang oryzalin, dinitroaniline compounds, disopyramide, benzamide-related compounds, ug ang ilang mga analogue makapugong sa microtubule function ug sa ingon makapugong sa pagtubo sa tanom.Busa, sila kaylap nga gigamit ingon nga mga herbicide.Bisan pa, tungod kay ang mga microtubule usa ka hinungdanon nga sangkap sa mga selula sa tanum ug hayop, kadaghanan sa mga inhibitor sa microtubule kay cytotoxic sa duha nga mga tipo sa selula.Busa, bisan pa sa ilang giila nga gamit isip mga herbicide, limitado nga gidaghanon sa mga antimicrotubule nga ahente ang gigamit alang sa praktikal nga mga katuyoan.
Ang Streptomyces kay usa ka genus sa pamilyang Streptomyces, nga naglakip sa aerobic, gram-positive, filamentous nga bakterya ug kaylap nga nailhan tungod sa abilidad niini sa pagprodyus og daghang mga secondary metabolites.Busa, kini giisip nga usa sa labing importante nga mga tinubdan sa bag-ong biologically aktibo nga natural nga mga produkto.Sa kasamtangan nga pagtuon, nadiskobrehan namo ang usa ka bag-ong compound nga gitawag og coumamonamide, nga nahimulag gikan sa Streptomyces werraensis MK493-CF1 ug S. werraensis ISP 5486. Gamit ang spectral analysis ug full spectral analysis, ang istruktura sa coumamonamide gihulagway ug ang talagsaon nga N-alkoxypyrrole skeleton niini. determinado.synthesis.Ang Ursmonic acid, usa ka sintetikong intermediate sa ursmonoamide ug mga derivatives niini, nakit-an nga makapugong sa pagtubo ug pagtubo sa sikat nga modelo nga tanum nga Arabidopsis thaliana.Sa usa ka structure-activity relationship study, among nakaplagan nga ang usa ka compound nga adunay C9 nga giusab ngadto sa ursonic acid, gitawag nga nonyloxy derivative of ursonic acid (KAND), makapauswag sa epekto sa pagpugong sa pagtubo ug pagtubo.Ilabi na, ang bag-ong nadiskobrehan nga tigpugong sa pagtubo sa tanum nakaapekto usab sa pagtubo sa tabako ug liverwort ug dili cytotoxic sa bakterya o mga selula sa HeLa.Dugang pa, ang pipila ka mga urmotonic acid derivatives nag-aghat sa usa ka gituis nga root phenotype, nga nagpasabot nga kini nga mga derivatives direkta o dili direkta nga makaapekto sa microtubule.Nahiuyon sa kini nga ideya, ang among mga obserbasyon sa mga microtubule nga gimarkahan nga immunohistochemically o adunay mga fluorescent nga protina nagpakita nga ang pagtambal sa KAND nag-depolymerize sa mga microtubule.Dugang pa, ang pagtambal sa kumamotonic acid derivatives nakabalda sa actin microfilaments.Busa, nadiskobrehan namo ang usa ka bag-ong tigpugong sa pagtubo sa tanom kansang talagsaong mekanismo sa paglihok naglakip sa pagkaguba sa cytoskeleton.
Ang strain MK493-CF1 gilain sa yuta sa Shinagawa-ku, Tokyo.Ang strain MK493-CF1 nagporma og maayo nga sanga nga stromal mycelium.Ang partial sequence sa 16S ribosomal RNA gene (1422 bp) gitino.Kini nga strain susama kaayo sa S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipikal nga strain, 99.93%).Pinasukad niini nga resulta, nahibal-an nga kini nga strain adunay suod nga kalambigitan sa tipo nga strain sa S. werraensis.Busa, among gihinganlan kini nga strain nga S. werraensis MK493-CF1.Ang S. werraensis ISP 5486T naghimo usab sa parehas nga bioactive compound.Tungod kay adunay gamay nga sayo nga panukiduki sa pagkuha sa natural nga mga produkto gikan niini nga microorganism, dugang nga panukiduki sa kemikal ang gihimo.Human sa kultibasyon sa S. werraensis MK493-CF1 sa barley medium pinaagi sa solid-state fermentation sa 30 ° C sulod sa 14 ka adlaw, ang medium gikuha sa 50% EtOH.Ang 60 ml nga sample gipauga aron makuha ang 59.5 mg nga krudo nga kinuha.Ang krudo nga kinuha gipailalom sa reverse phase HPLC aron mahatagan ang N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, ginganlan og coumamonamide, 36.0 mg).Ang kinatibuk-ang kantidad sa 1 mao ang gibana-bana nga 60% sa krudo nga kinuha.Busa, nakahukom kami sa pagtuon sa detalye sa mga kabtangan sa kumamotoamide 1.
Ang Coumamonamide 1 usa ka puti nga amorphous powder ug high resolution mass spectrometry (HRESIMS) nagpamatuod sa C6H8N2O2 (Fig. 1).Ang C2-substituted pyrrole fragment niini nga compound gihulagway sa δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH sa 1H NMR spectrum: 4.5 Hz , H-5) ug δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), ug ang 13C NMR spectrum nagpakita sa presensya sa upat ka sp2 carbon atoms.Ang presensya sa usa ka grupo sa amide sa posisyon sa C2 gisusi sa HMBC correlation gikan sa C-3 proton ngadto sa amide carbonyl carbon sa δC 161.1.Dugang pa, ang 1 H ug 13 C NMR peak sa δH 4.10 (3H, S) ug δC 68.3 nagpakita sa presensya sa N-methoxy nga mga grupo sa molekula.Bisan tuod ang husto nga posisyon sa methoxy nga grupo wala pa matino gamit ang spectroscopic analysis sama sa enhanced difference spectroscopy ug nuclear Overhauser abbreviation (NOEDF), ang N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide nahimong unang candidate compound.
Aron mahibal-an ang husto nga istruktura sa 1, usa ka kinatibuk-ang synthesis ang gihimo (Fig. 2a).Ang pagtambal sa 2-aminopyridine 2 sa komersyo nga adunay m-CPBA miresulta sa katumbas nga N-oxide 3 sa quantitative yield.Pagkahuman sa 2-aminoazidation sa 2, ang reaksyon sa cyclocondensation nga gihulagway ni Abramovich gihimo sa benzene sa 90 ° C aron makuha ang gitinguha nga 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 sa gramo.Speed 60% (duha ka yugto).15,16.Ang methylation ug hydrolysis sa 4 dayon naghatag og 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (gitawag nga "cumotonic acid", 6) sa maayong abot (70%, duha ka lakang).Sa kataposan, ang amidation pinaagi sa acid chloride intermediate 6 gamit ang aqueous ammonia naghatag sa Kumamoto amide 1 sa 98% nga abot.Ang tanan nga spectral data sa synthesized 1 susama sa hilit nga 1, mao nga ang istruktura sa 1 determinado;
Kinatibuk-ang synthesis ug pagtuki sa biological nga kalihokan sa urbenamide ug urbenic acid.(a) Kinatibuk-ang synthesis sa Kumamoto amide.(b) Ang pito ka adlaw nga ihalas nga tipo nga Arabidopsis Columbia (Col) nga mga seedling gipatubo sa Murashige ug Skoog (MS) nga mga plato nga adunay coumamonamide 6 o coumamonamide 1 sa gipakita nga konsentrasyon.Scale bar = 1 cm.
Una, among gisusi ang biolohikal nga mga kalihokan sa urbenamide ug ang mga intermediate niini alang sa ilang abilidad sa pag-modulate sa pagtubo sa tanum.Among gidugang ang lain-laing mga konsentrasyon sa ursmonamide 1 o ursmonic acid 6 ngadto sa MS agar medium ug kultura nga Arabidopsis thaliana nga mga seedling niini nga medium.Kini nga mga assay nagpakita nga ang taas nga konsentrasyon (500 μM) sa 6 nakapugong sa pagtubo sa gamut (Fig. 2b).Sunod, nakamugna kami og lain-laing mga derivatives pinaagi sa pag-ilis sa N1 nga posisyon sa 6 ug gihimo ang structure-activity relationship studies sa kanila (ang analogue synthesis nga proseso gihulagway sa Supporting Information (SI)).Ang Arabidopsis nga mga seedling gipatubo sa medium nga adunay 50 μM ursonic acid derivatives, ug ang gitas-on sa gamut gisukod.ingon sa gipakita sa litrato.Sama sa gipakita sa Figures 3a, b, ug S1, ang mga coumamo acid adunay lain-laing mga gitas-on sa linear alkoxy chain (9, 10, 11, 12, ug 13) o dagkong alkoxy chain (15, 16, ug 17) sa N1 nga posisyon.Ang mga derivatives nagpakita sa mahinungdanon nga pagpugong sa pagtubo sa gamut.Dugang pa, among nakita nga ang paggamit sa 200 μM 10, 11, o 17 makapugong sa pagtubo (Fig. 3c ug S2).
Pagtuon sa gambalay-kalihokan nga relasyon sa Kumamoto amide ug may kalabutan nga mga compound.(a) Iskema sa istruktura ug synthesis sa mga analogue.(b) Pag-ihap sa gitas-on sa gamut sa 7 ka adlaw nga mga seedling nga gipatubo sa MS medium nga adunay o walay 50 μM nga coumamonamide derivatives.Ang mga asterisk nagpakita sa mahinungdanong mga kalainan sa sham treatment (t test, p<0.05).n>18. Gipakita ang datos isip mean ± SD.Ang nt nagpasabut nga "wala gisulayan" tungod kay labaw sa 50% sa mga liso wala moturok.(c) Pag-ihap sa rate sa pagtubo sa giatiman nga mga liso nga gilumlom sa 7 ka adlaw sa medium nga MS nga adunay o wala’y 200 μM coumamonamide ug mga kauban nga compound.Ang mga asterisk nagpakita sa mahinungdanong kalainan sa sham treatment (chi-square test).n=96.
Makapainteres, ang pagdugang sa mga kadena sa kilid sa alkyl nga mas taas kaysa C9 nakapakunhod sa kalihokan sa pagpugong, nga nagsugyot nga ang mga compound nga may kalabotan sa kumamotoic acid nanginahanglan mga kadena sa kilid nga adunay usa ka gidak-on aron ipakita ang ilang biolohikal nga kalihokan.
Tungod kay ang pag-analisar sa relasyon sa istruktura-aktibidad nagpakita nga ang C9 giusab ngadto sa ursonic acid ug ang nonyloxy derivative sa ursonic acid (katapos gitawag nga KAND 11) mao ang labing epektibo nga tigpugong sa pagtubo sa tanum, nagpahigayon kami og mas detalyado nga kinaiya sa KAND 11. Pagtambal sa Arabidopsis nga adunay 50 μM KAND 11 halos hingpit nga nakapugong sa pagtubo, samtang ang ubos nga konsentrasyon (40, 30, 20, o 10 μM) sa KAND 11 nagpugong sa pagtubo sa gamut sa usa ka paagi nga nagsalig sa dosis (Fig. 4a, b).Aron masulayan kung ang KAND 11 makaapekto sa root meristem viability, among gisusi ang mga root meristem nga namansahan sa propidium iodide (PI) ug gisukod ang gidak-on sa meristem area.Ang gidak-on sa meristem sa mga seedling nga gipatubo sa usa ka medium nga adunay sulod nga 25 μM KAND-11 mao ang 151.1 ± 32.5 μm, samtang ang gidak-on sa meristem sa mga seedling nga gipatubo sa usa ka control medium nga adunay DMSO mao ang 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d) , nga nagpakita nga ang KAND-11 nagpasig-uli sa kalihokan sa cellular.mikaylap.Ang gamut nga meristem.Nahiuyon niini, ang KAND 11 nga pagtambal nagpamenos sa gidaghanon sa cell division marker CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signal sa root meristem (Fig. 4e) 17.Kini nga mga resulta nagpakita nga ang KAND 11 nagpugong sa pagtubo sa gamut pinaagi sa pagkunhod sa kalihokan sa pagdaghan sa selula.
Pag-analisar sa epekto sa pagpugong sa urbenonic acid derivatives (urbenyloxy derivatives) sa pagtubo.(a) 7 ka adlaw nga wild-type nga Col seedlings nga gipatubo sa MS plates nga adunay gipakita nga konsentrasyon sa KAND 11. Scale bar = 1 cm.(b) Pag-ihap sa gitas-on sa gamut.Ang mga sulat nagpaila sa mahinungdanong mga kalainan (Tukey HSD test, p<0.05).n>16. Gipakita ang datos isip mean ± SD.(c) Confocal microscopy sa propidium iodide-stained wild-type nga Col roots nga gipatubo sa MS plate nga adunay o walay 25 μM KAND 11. Ang puti nga mga bracket nagpakita sa root meristem.Scale bar = 100 µm.(d) Pag-ihap sa gidak-on sa meristem sa gamut (n = 10 hangtod 11).Ang mga kalainan sa estadistika gitino gamit ang t-test (p<0.05).Ang mga bar nagrepresentar sa kasagaran nga gidak-on sa meristem.(e) Differential interference contrast (DIC) microscopy sa usa ka root meristem nga naglangkob sa CDKB2 construct;1pro: CDKB2;Ang 1-GUS gimantsa ug gimantsa sa 5 ka adlaw nga mga seedling nga gipatubo sa MS plate nga adunay o walay 25 µM KAND assay.
Ang phytotoxicity sa KAND 11 dugang gisulayan gamit ang lain nga dicotyledonous nga tanum, tabako (Nicotiana tabacum), ug usa ka mayor nga yuta nga modelo nga organismo, liverwort (Marchantia polymorpha).Sama sa kaso sa Arabidopsis, ang tabako nga SR-1 nga mga seedling nga gipatubo sa medium nga adunay sulod nga 25 μM KAND 11 nagpatunghag mas mugbo nga mga gamot (Fig. 5a).Dugang pa, 40 sa 48 ka liso miturok sa mga plato nga adunay 200 μM KAND 11, samtang ang tanang 48 ka liso miturok sa mock-treated media, nga nagpakita nga mas taas nga konsentrasyon sa KAND mahinungdanon (p< 0.05;chi test -square) nagpugong sa pagtubo sa tabako.(Fig. 5b).Dugang pa, ang konsentrasyon sa KAND 11 nga nagpugong sa pagtubo sa bakterya sa liverwort susama sa epektibo nga konsentrasyon sa Arabidopsis (Fig. 5c).Kini nga mga resulta nagpakita nga ang KAND 11 makapugong sa pagtubo sa lain-laing mga tanom.Gisusi dayon namo ang posibleng cytotoxicity sa bear monoamide-related compounds sa ubang mga organismo, nga mao ang human HeLa cells ug Escherichia coli strain DH5α, isip mga representante sa mas taas nga mananap ug bacterial cells, matag usa.Sa usa ka serye sa mga pagsulay sa pagdaghan sa selula, among naobserbahan nga ang coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, ug KAND 11 wala makaapekto sa pagtubo sa HeLa o E. coli nga mga selula sa konsentrasyon nga 100 μM (Fig. 5d, e).
Pagpugong sa pagtubo sa KAND 11 sa mga non-Arabidopsis nga organismo.(a) Duha ka semana nga wild-type nga SR-1 nga mga seedling sa tabako gipatubo sa vertically positioned MS plates nga adunay sulod nga 25 μM KAND 11. (b) Ang duha ka semana nga wild-type nga SR-1 nga mga seedling sa tabako gipatubo sa pinahigda nga posisyon. Ang mga plato sa MS nga adunay sulod nga 200 μM KAND 11. ( c) Duha ka semana nga ihalas nga tipo nga Tak-1 liverwort buds nga gipatubo sa Gamborg B5 nga mga palid nga adunay gipakita nga konsentrasyon sa KAND 11. Ang pula nga mga pana nagpakita sa mga spore nga mihunong sa pagtubo sulod sa duha ka semana nga paglumlum. panahon.(d) Cell proliferation assay sa mga selula sa HeLa.Ang gidaghanon sa mabuhi nga mga selula gisukod sa gitakdang mga agwat sa panahon gamit ang cell counting kit 8 (Dojindo).Ingon usa ka kontrol, ang mga selula sa HeLa gitambalan nga adunay 5 μg / ml actinomycin D (Act D), nga nagpugong sa transkripsyon sa RNA polymerase ug hinungdan sa pagkamatay sa cell.Ang mga pag-analisar gihimo sa triplicate.(e) E. coli cell proliferation assay.Ang pagtubo sa E. coli gisusi pinaagi sa pagsukod sa OD600.Isip kontrol, ang mga selula gitambalan sa 50 μg/ml nga ampicillin (Amp), nga makapugong sa bacterial cell wall synthesis.Ang mga pag-analisar gihimo sa triplicate.
Aron mahibal-an ang mekanismo sa aksyon sa cytotoxicity nga gipahinabo sa mga compound nga may kalabotan sa uramide, among gisusi pag-usab ang mga derivatives sa urbenic acid nga adunay kasarangan nga mga epekto sa pagpugong.ingon sa gipakita sa litrato.Sama sa gipakita sa Figures 2b, 6a, ang mga seedling nga gipatubo sa agar plates nga adunay taas nga konsentrasyon (200 μM) sa urmotonic acid 6 nagpatunghag mas mugbo ug left-curved nga mga gamot (θ = - 23.7 ± 6.1), samtang sa mga seedling nga mitubo sa control medium, ang ang mga semilya nagpatunghag halos tul-id nga mga gamot (θ = – 3.8 ± 7.1).Kini nga kinaiya nga oblique nga pagtubo nahibal-an nga resulta sa dysfunction sa cortical microtubule14,18.Nahiuyon sa kini nga pagpangita, ang microtubule-destabilizing nga mga tambal nga disopyramide ug oryzalin nag-aghat sa parehas nga pagkiling sa gamut ubos sa among mga kondisyon sa pagtubo (Fig. 2b, 6a).Sa samang higayon, gisulayan namo ang urmotonic acid derivatives ug gipili ang ubay-ubay niini nga, sa pipila ka mga konsentrasyon, nag-aghat sa oblique root growth.Ang mga compound 8, 9, ug 15 nag-usab sa direksyon sa pagtubo sa gamut sa 75 μM, 50 μM, ug 40 μM, matag usa, nga nagpakita nga kini nga mga compound epektibo nga makaguba sa microtubule (Fig. 2b, 6a).Gisulayan usab namo ang labing kusog nga ursolic acid derivative, KAND 11, sa ubos nga konsentrasyon (15 µM) ug nakit-an nga ang paggamit sa KAND 11 nagpugong sa pagtubo sa gamut ug nga ang direksyon sa pagtubo sa gamut dili patas, bisan pa nga sila adunay hilig sa bakilid sa wala ( Hulagway C3)..Tungod kay ang mas taas nga konsentrasyon sa microtubule-destabilizing nga mga tambal usahay makapugong sa pagtubo sa tanum imbes nga hinungdan sa pagkiling sa gamut, pagkahuman gisusi namon ang posibilidad nga ang KAND 11 makaapekto sa microtubule pinaagi sa pag-obserbar sa cortical microtubules sa root epidermal cells.Ang immunohistochemistry gamit ang anti-β-tubulin antibodies sa epidermal cells sa seedling roots nga gitambalan sa 25 μM KAND 11 nagpakita sa pagkawala sa halos tanang cortical microtubules sa epidermal cells sa elongation zone (Fig. 6b).Kini nga mga resulta nagpakita nga ang kumamotonic acid ug ang mga gigikanan niini direkta o dili direkta nga molihok sa mga microtubule aron mabalda kini ug nga kini nga mga compound usa ka bag-ong microtubule inhibitor.
Ang Ursonic acid ug ang mga derivatives niini nag-usab sa cortical microtubule sa Arabidopsis thaliana.(a) Root inclination angle gisukod sa presensya sa nagkalain-laing urmotonic acid derivatives sa gipakita nga konsentrasyon.Ang mga epekto sa duha ka mga compound nga nahibal-an nga makapugong sa mga microtubule: disopyramide ug oryzalin gisusi usab.Ang inset nagpakita sa sumbanan nga gigamit sa pagsukod sa anggulo sa pagtubo sa ugat.Ang mga asterisk nagpakita sa mahinungdanong mga kalainan sa sham treatment (t test, p<0.05).n>19. Scale bar = 1 cm.(b) Cortical microtubule sa epidermal cells sa elongation zone.Ang mga microtubule sa wild-type nga Arabidopsis Col nga mga ugat nga gipatubo sa mga plato sa MS nga adunay o wala ang 25 μM KAND 11 gitan-aw pinaagi sa immunohistochemical staining gamit ang β-tubulin primary antibodies ug Alexa Fluor-conjugated secondary antibodies.Scale bar = 10 µm.(c) Mitotic nga istruktura sa microtubule sa gamut meristem.Gitan-aw ang mga microtubule gamit ang immunohistochemical staining.Mitotic nga mga istruktura, lakip ang prophase zones, spindles, ug phragmoplasts, giihap gikan sa confocal nga mga hulagway.Ang mga pana nagpakita sa mitotic microtubule nga mga istruktura.Ang mga asterisk nagpakita sa mahinungdanong mga kalainan sa sham treatment (t test, p<0.05).n>9. Scale bar = 50 µm.
Bisan tuod ang Ursa adunay katakus nga makabalda sa microtubule function, ang mekanismo sa paglihok niini gilauman nga lahi sa kasagaran nga microtubule depolymerizing agents.Pananglitan, ang mas taas nga konsentrasyon sa microtubule depolymerizing agents sama sa disopyramide ug oryzalin nag-aghat sa anisotropic nga pagpalapad sa epidermal cells, samtang ang KAND 11 wala.Dugang pa, ang co-application sa KAND 11 ug disopyramide miresulta sa usa ka hiniusa nga disopyramide-induced root growth response ug KAND 11-induced growth inhibition naobserbahan (Fig. S4).Gisusi usab namo ang tubag sa hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant sa KAND 11. Ang phs1-1 adunay non-canonical tubulin kinase point mutation ug nagpatunghag mas mugbo nga mga gamot kung gitambalan sa disopyramide9,20.Ang phs1-1 mutant seedlings nga gipatubo sa agar medium nga adunay KAND 11 adunay mas mugbo nga mga gamot susama sa mitubo sa disopyramid (fig. S5).
Dugang pa, among naobserbahan ang mitotic microtubule structures, sama sa prophase zones, spindles, ug phragmoplasts, sa root meristem sa mga seedling nga gitambalan sa KAND 11. Nahiuyon sa mga obserbasyon sa CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, usa ka mahinungdanong pagkunhod sa ang gidaghanon sa mitotic microtubule naobserbahan (Fig. 6c).
Aron mahibal-an ang cytotoxicity sa KAND 11 sa subcellular resolution, among gitambalan ang tabako BY-2 suspension cells nga adunay KAND 11 ug giobserbahan ang ilang tubag.Una namon nga gidugang ang KAND 11 sa BY-2 nga mga selyula nga nagpahayag sa TagRFP-TUA6, nga fluorescently nag-label sa mga microtubule, aron masusi ang epekto sa KAND 11 sa cortical microtubules.Ang densidad sa cortical microtubule gisusi gamit ang pag-analisa sa imahe, nga nag-ihap sa porsyento sa mga cytoskeletal pixels taliwala sa mga cytoplasmic pixels.Ang mga resulta sa assay nagpakita nga human sa pagtambal sa 50 μM o 100 μM KAND 11 sulod sa 1 ka oras, ang densidad mikunhod pag-ayo ngadto sa 0.94 ± 0.74% o 0.23 ± 0.28%, matag usa, samtang ang densidad sa mga selula nga gitambalan sa DMSO, mikabat sa 1.61 ± 0.34 % (Fig. 7a).Kini nga mga resulta nahiuyon sa obserbasyon sa Arabidopsis nga ang KAND 11 nga pagtambal nag-aghat sa depolymerization sa cortical microtubules (Fig. 6b).Gisusi usab namo ang linya sa BY-2 nga adunay mga filament nga actin nga adunay label nga GFP-ABD pagkahuman sa pagtambal nga adunay parehas nga konsentrasyon sa KAND 11 ug naobserbahan nga ang pagtambal sa KAND 11 nakabalda sa mga filament sa actin.Ang pagtambal nga adunay 50 μM o 100 μM KAND 11 alang sa 1 h hinungdanon nga pagkunhod sa actin filament density sa 1.20 ± 0.62% o 0.61 ± 0.26%, matag usa, samtang ang density sa mga cell nga gitambalan sa DMSO mao ang 1.69 ± 0.51% (Fig.7b).Kini nga mga resulta lahi sa mga epekto sa propyzamide, nga dili makaapekto sa actin filaments, ug latrunculin B, usa ka actin depolymerizer nga dili makaapekto sa microtubule (SI Figure S6).Dugang pa, ang pagtambal sa coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, o KAND 11 wala makaapekto sa microtubule sa HeLa cells (SI Figure S7).Sa ingon, ang mekanismo sa aksyon sa KAND 11 gituohan nga lahi sa nahibal-an nga cytoskeleton disruptors.Dugang pa, ang among mikroskopiko nga obserbasyon sa mga BY-2 nga mga selula nga gitambalan sa KAND 11 nagpadayag sa pagsugod sa pagkamatay sa cell sa panahon sa pagtambal sa KAND 11 ug gipakita nga ang proporsyon sa Evans nga adunay asul nga mga patay nga mga selyula wala modako pag-ayo pagkahuman sa 30 min sa pagtambal sa KAND 11, samtang human sa 90 minutos nga pagtambal sa 50 μM o 100 μM KAND, ang gidaghanon sa mga patay nga selula misaka ngadto sa 43.7% o 80.1%, matag usa (Fig. 7c).Gikuha, kini nga mga datos nagpakita nga ang nobela nga ursolic acid derivative nga KAND 11 usa ka plant-specific cytoskeletal inhibitor nga adunay kaniadto wala mahibal-an nga mekanismo sa aksyon.
Ang KAND makaapekto sa cortical microtubule, actin filament, ug viability sa tabako BY-2 nga mga selula.(a) Visualization sa cortical microtubule sa BY-2 nga mga selula sa presensya sa TagRFP-TUA6.Ang BY-2 nga mga selula nga gitambalan sa KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO gisusi sa confocal microscopy.Ang densidad sa cortical microtubule gikalkulo gikan sa micrographs sa 25 ka independente nga mga selula.Ang mga sulat nagpaila sa mahinungdanong mga kalainan (Tukey HSD test, p<0.05).Scale bar = 10 µm.(b) Cortical actin filaments sa BY-2 nga mga selula nga makita sa presensya sa GFP-ABD2.Ang BY-2 nga mga selula nga gitambalan sa KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO gisusi sa confocal microscopy.Ang densidad sa cortical actin filament gikalkulo gikan sa micrographs sa 25 ka independenteng mga selula.Ang mga sulat nagpaila sa mahinungdanong mga kalainan (Tukey HSD test, p<0.05).Scale bar = 10 µm.(c) Pag-obserbar sa patay nga BY-2 nga mga selyula pinaagi sa Evans blue nga pagmantsa.Ang BY-2 nga mga selula nga gitambalan sa KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO gisusi pinaagi sa bright-field microscopy.n=3.Scale bar = 100 µm.
Ang pagkadiskobre ug paggamit sa bag-ong natural nga mga produkto misangpot sa mahinungdanong pag-uswag sa nagkalain-laing aspeto sa kinabuhi sa tawo, lakip na ang medisina ug agrikultura.Ang mga panukiduki sa kasaysayan gihimo aron makakuha mga mapuslanon nga compound gikan sa natural nga kahinguhaan.Sa partikular, ang actinomycetes nahibal-an nga mapuslanon isip antiparasitic antibiotics alang sa nematodes tungod sa ilang abilidad sa pagprodyus og nagkalain-laing secondary metabolites sama sa avermectin, ang lead compound sa ivermectin ug bleomycin ug ang mga derivatives niini, nga gigamit nga tambal isip anticancer agent21,22.Sa samang paagi, nadiskobrehan ang lain-laing mga herbicidal compound gikan sa actinomycetes, ang uban niini gigamit na sa komersyo1,23.Busa, ang pag-analisa sa mga metabolite sa actinomycete aron mahimulag ang mga natural nga produkto nga adunay gusto nga biolohikal nga mga kalihokan giisip nga usa ka epektibo nga estratehiya.Niini nga pagtuon, nadiskobrehan namo ang usa ka bag-ong compound, coumamonamide, gikan sa S. werraensis ug malampuson nga na-synthesize kini.Ang Ursonic acid usa ka sintetikong intermediate sa urbenamide ug mga derivatives niini.Mahimo kini nga hinungdan sa kinaiya nga pagkulot sa gamut, pagpakita sa kasarangan hangtod sa kusog nga herbicidal nga kalihokan, ug direkta o dili direkta nga makadaot sa microtubule sa tanum.Bisan pa, ang mekanismo sa aksyon sa urmotonic acid mahimong lahi sa mga naglungtad nga microtubule inhibitors, tungod kay ang KAND 11 usab makabalda sa mga filament sa actin ug hinungdan sa pagkamatay sa cell, nga nagsugyot sa usa ka mekanismo sa regulasyon diin ang urmotonic acid ug ang mga gigikanan niini nag-impluwensya sa daghang mga istruktura sa cytoskeletal..
Ang dugang nga detalyado nga paghulagway sa urbenonic acid makatabang aron mas masabtan ang mekanismo sa aksyon sa urbenonic acid.Sa partikular, ang sunod nga tumong mao ang pagtimbang-timbang sa abilidad sa ursonic acid sa paggapos ngadto sa pagkunhod sa microtubules aron sa pagtino kon ang ursonic acid ug ang mga derivatives niini molihok direkta sa microtubules ug depolymerize kanila, o kon ang ilang aksyon resulta sa microtubule destabilization.Dugang pa, sa kaso diin ang mga microtubule dili direkta nga target, ang pag-ila sa site sa aksyon ug mga target sa molekula sa ursonic acid sa mga selula sa tanum makatabang sa dugang nga pagsabut sa mga kabtangan sa mga may kalabutan nga mga compound ug posible nga mga paagi aron mapaayo ang kalihokan sa herbicidal.Ang among bioactivity assay nagpadayag sa talagsaong cytotoxic nga abilidad sa ursonic acid sa pagtubo sa mga tanom sama sa Arabidopsis thaliana, tabako ug liverwort, samtang walay E. coli o HeLa nga mga selula ang naapektuhan.Ang gamay o walay toxicity sa mga selula sa hayop usa ka bentaha sa ursonic acid derivatives kung kini gihimo isip mga herbicide aron gamiton sa bukas nga mga umahan sa agrikultura.Sa tinuud, tungod kay ang mga microtubule sagad nga istruktura sa mga eukaryote, ang ilang gipili nga pagpugong sa mga tanum usa ka hinungdanon nga kinahanglanon alang sa mga herbicide.Pananglitan, ang propyzamide, usa ka microtubule depolymerizing agent nga direktang nagbugkos sa tubulin ug nagpugong sa polymerization, gigamit isip herbicide tungod sa ubos nga toxicity niini sa mga selula sa hayop24.Sukwahi sa disopyramide, ang mga may kalabotan nga benzamide adunay lainlaing mga piho nga target.Gawas pa sa mga microtubule sa tanum, ang RH-4032 o benzoxamide usab nagpugong sa microtubules sa mga selula sa hayop o oomycetes, matag usa, ug ang zalilamide gigamit ingon usa ka fungicide tungod sa ubos nga phytotoxicity25,26,27.Ang bag-ong nadiskobrehan nga oso ug ang mga gigikanan niini nagpakita sa pinili nga cytotoxicity batok sa mga tanum, apan angay nga hinumdoman nga ang dugang nga mga pagbag-o mahimo’g magbag-o sa ilang target nga piho, mahimo’g maghatag dugang nga mga gigikanan alang sa pagpugong sa mga pathogen fungi o oomycetes.
Ang talagsaon nga mga kabtangan sa urbenonic acid ug ang mga gigikanan niini mapuslanon alang sa ilang pag-uswag ingon mga herbicide ug gigamit ingon mga himan sa panukiduki.Ang importansya sa cytoskeleton sa pagkontrolar sa porma sa selula sa tanom kaylap nga giila.Gipakita sa mga naunang pagtuon nga ang mga tanum nag-uswag sa komplikado nga mga mekanismo sa cortical microtubule nga organisasyon pinaagi sa pagkontrol sa microtubule dynamics aron husto nga makontrol ang morphogenesis.Daghang mga molekula nga responsable sa regulasyon sa kalihokan sa microtubule ang nahibal-an, ug ang may kalabutan nga panukiduki nagpadayon pa3,4,28.Ang among kasamtangan nga pagsabot sa microtubule dynamics sa mga selula sa tanum dili hingpit nga nagpatin-aw sa mga mekanismo sa cortical microtubule nga organisasyon.Pananglitan, bisan tuod ang disopyramide ug oryzalin maka-depolymerize sa mga microtubule, ang disopyramide maoy hinungdan sa grabeng distorsyon sa ugat samtang ang oryzalin adunay medyo malumo nga epekto.Dugang pa, ang mga mutasyon sa tubulin, nga nagpalig-on sa mga microtubule, hinungdan usab sa dextrorotation sa mga gamot, samtang ang paclitaxel, nga nagpalig-on usab sa microtubule dynamics, wala.Busa, ang pagtuon ug pag-ila sa mga target sa molekula sa ursolic acid kinahanglan maghatag ug bag-ong mga panabut sa regulasyon sa mga cortical microtubule sa tanum.Ingon usab, ang umaabot nga pagtandi sa mga kemikal nga epektibo sa pagpasiugda sa hiwi nga pagtubo, sama sa disopyramide, ug dili kaayo epektibo nga mga kemikal, sama sa oryzalin o kumamotoric acid, maghatag mga timailhan kung giunsa nahitabo ang hiwi nga pagtubo.
Sa laing bahin, ang mga pag-usab sa cytoskeletal nga may kalabotan sa depensa maoy laing posibilidad nga ipatin-aw ang cytotoxicity sa ursonic acid.Ang impeksyon sa usa ka pathogen o pagpasulod sa usa ka elicitor ngadto sa mga selula sa tanum usahay hinungdan sa pagkaguba sa cytoskeleton ug sunod nga pagkamatay sa cell29.Pananglitan, ang cryptoxanthin nga nakuha sa oomycete gikataho nga makabalda sa mga microtubule ug actin filament sa wala pa mamatay ang selyula sa tabako, susama sa nahitabo sa pagtambal sa KAND30,31.Ang pagkaparehas tali sa mga tubag sa depensa ug mga tubag sa cellular nga gipahinabo sa ursonic acid nagdala kanamo sa hypothesize nga kini nag-aghat sa kasagaran nga mga proseso sa cellular, bisan kung ang usa ka mas paspas ug mas kusog nga epekto sa ursonic acid kay sa cryptoxanthin makita.Bisan pa, gipakita sa mga pagtuon nga ang pagkabalda sa mga filament sa actin nagpasiugda sa kusog nga pagkamatay sa cell, nga dili kanunay nga giubanan sa pagkaguba sa microtubule29.Dugang pa, kini nagpabilin nga makita kung ang pathogen o elicitor hinungdan sa hiwi nga pagtubo sa gamut, sama sa ursonic acid derivatives.Busa, ang kahibalo sa molekula nga nagsumpay sa mga tubag sa depensa ug ang cytoskeleton usa ka madanihon nga problema nga sulbaron.Pinaagi sa pagpahimulos sa presensya sa mubu nga molekular nga gibug-aton nga mga compound nga may kalabutan sa ursonic acid, ingon man usa ka lainlaing mga derivatives nga adunay lainlaing mga potensyal, mahimo’g maghatag sila mga oportunidad sa pag-target sa wala mailhi nga mga mekanismo sa cellular.
Sa tingub, ang pagkadiskobre ug paggamit sa bag-ong mga compounds nga modulate microtubule dynamics maghatag gamhanan nga mga pamaagi sa pagsulbad sa mga komplikado molekular mekanismo nga nagpahipi sa tanom cell porma determinasyon.Niini nga konteksto, ang bag-o lang naugmad nga compound nga urmotonic acid, nga nakaapekto sa mga microtubule ug actin filament ug hinungdan sa pagkamatay sa cell, mahimo’g maghatag higayon nga mahibal-an ang koneksyon tali sa pagkontrol sa microtubule ug kini nga uban pang mga mekanismo.Busa, ang kemikal ug biolohikal nga pagtuki gamit ang urbenonic acid makatabang nato nga masabtan ang mga mekanismo sa regulasyon sa molekula nga nagkontrolar sa cytoskeleton sa tanom.
Inoculate ang S. werraensis MK493-CF1 ngadto sa usa ka 500 mL baffled Erlenmeyer flask nga adunay sulod nga 110 mL nga seed medium nga naglangkob sa 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence paste, 1% ( w/v) Bacto composition .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) corn extract (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 ug 0.2% CaCO3 sa deionized nga tubig.(pH 7.4 sa wala pa ang sterilization).Ang mga liso nga kultura gilumlom sa rotary shaker (180 rpm) sa 27°C sulod sa 2 ka adlaw.Pag-ugmad sa produksyon pinaagi sa solid state fermentation.Ang seed culture (7 ml) gibalhin ngadto sa 500 ml K-1 flask nga adunay sulod nga 40 g nga production medium nga gilangkuban sa 15 g nga pressed barley (MUSO Co., Ltd., Japan) ug 25 g nga deionized nga tubig (pH not adjusted). sa wala pa ang sterilization).).Ang fermentation gihimo sa 30 ° C sa kangitngit sulod sa 14 ka adlaw.Ang fermentation nga materyal gikuha uban sa 40 ml/botelya EtOH ug centrifuged (1500 g, 4 ° C, 10 min).Ang supernatant sa kultura (60 ml) gikuha sa usa ka sinagol nga 10% MeOH/EtOAc.Ang organikong layer nahurot ubos sa pagkunhod sa presyur aron makakuha usa ka nahabilin (59.5 mg), nga gipailalom sa HPLC nga adunay gradient elution (0-10 minuto: 90%) sa usa ka reverse phase column (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × gitas-on 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutos: 90% H2O/CH3CN ngadto sa 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minutos: 90% H2O/EtOH, 45–155 minutos: 90% H2O / EtOH ngadto sa 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 min: 100% EtOH) sa usa ka flow rate nga 1.5 ml / min, ang coumamonamide (1, 36.0 mg) gilain isip puti nga amorphous powder.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ kalkulado nga bili: 141.0659, gisukod nga bili: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1538 cm
Ang mga liso sa Columbia (Col-0) nakuha gikan sa Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) nga adunay pagtugot alang sa paggamit sa panukiduki.Ang mga liso sa Col-0 gipakaylap ug gimentinar ubos sa among kahimtang sa laboratoryo ug gigamit isip wild-type nga Arabidopsis nga mga tanom.Ang mga liso sa Arabidopsis kay na-sterilize sa nawong ug gi-kultura sa tunga nga kusog nga Murashige ug Skoog medium nga adunay 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ).) ug 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, sa 23 °C ug kanunay nga kahayag.Ang mga liso sa phs1-1 mutant gihatag ni T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Ang mga liso sa strain SR-1 gihatag ni T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) ug gigamit isip wild-type nga mga tanom nga tabako.Ang mga liso sa tabako gi-sterilize sa nawong ug gihumol sa sterile nga tubig sulod sa tulo ka gabii aron mapalambo ang pagtubo, dayon ibutang sa tunga nga kusog nga solusyon nga adunay 2% nga sucrose, 0.05% (w/v) MES, ug 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.ug Skoog medium) nga adunay pH 5.7 ug gilumlum sa 23 ° C ubos sa kanunay nga kahayag.
Ang Strain Tak-1 gihatag sa T. Kohchi (Kyoto University) ug gigamit isip standard experimental unit alang sa liverwort study.Ang Gemma nakuha gikan sa sterilized cultured nga mga tanom ug dayon gitabonan sa Gamborg B5 medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) nga adunay sulod nga 1% sucrose ug 0.3% gellan gum ug gilumlom sa 23°C ubos sa padayon nga kahayag.
Ang tabako BY-2 nga mga selula (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) gihatag ni S. Hasezawa (University of Tokyo).Ang BY-2 nga mga selula natunaw sa 95 ka pilo sa giusab nga Linsmeier ug Skoog medium ug gidugangan kada semana sa 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32.Ang cell suspension gisagol sa usa ka rotary shaker sa 130 rpm sa 27 ° C sa kangitngit.Hugasi ang mga selula nga adunay 10 ka pilo nga gidaghanon sa presko nga medium ug i-resuspend sa samang medium.BY-2 transgenic cell linya stably nagpahayag sa microtubule marker TagRFP-TUA6 o ang actin filament marker GFP-ABD2 ubos sa cauliflower mosaic virus 35S promoter namugna ingon sa gihulagway33,34,35.Kini nga mga linya sa cell mahimong mapadayon ug i-synchronize gamit ang mga pamaagi nga parehas sa gigamit alang sa orihinal nga linya sa BY-2 cell.
Ang mga selula sa HeLa gi-culture sa Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) nga gidugangan sa 10% fetal bovine serum, 1.2 U/ml penicillin, ug 1.2 μg/ml streptomycin sa 37°C incubator nga adunay 5% CO2.
Ang tanan nga mga eksperimento nga gihulagway niini nga manuskrito gihimo sumala sa mga regulasyon ug mga sumbanan sa biosafety sa Japan.
Ang mga compound natunaw sa dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) isip mga solusyon sa stock ug lasaw sa MS medium para sa Arabidopsis ug tabako o Gamborg B5 medium para sa liverwort.Para sa root growth inhibition assay, kapin sa 10 ka liso kada plato ang gipugas sa agar medium nga adunay sulod nga mga compound o DMSO.Ang mga liso gilumlom sa usa ka lawak sa pagtubo sulod sa 7 ka adlaw.Ang mga seedling gikuhaan og litrato ug ang gitas-on sa mga gamot gisukod.Para sa Arabidopsis germination assay, 48 ka liso kada plato ang gipugas sa agar medium nga adunay 200 μM compound o DMSO.Ang mga liso sa Arabidopsis gipatubo sa usa ka lawak sa pagtubo ug ang gidaghanon sa miturok nga mga seedling giihap 7 ka adlaw human sa pagtubo (dag).Para sa germination assay sa tabako, 24 ka liso kada plato ang gipugas sa agar medium nga adunay sulod nga 200 μM KAND o DMSO.Ang mga liso sa tabako gipatubo sa usa ka lawak sa pagtubo ug ang gidaghanon sa miturok nga mga seedling giihap human sa 14 ka adlaw.Alang sa liverwort growth inhibition assay, 9 ka mga embryo gikan sa matag plato ang gibutang sa agar medium nga adunay sulod nga gipakita nga konsentrasyon sa KAND o DMSO ug gilumlom sa usa ka lawak sa pagtubo sulod sa 14 ka adlaw.
Gamita ang mga seedling nga gimantsa sa 5 mg/ml propidium iodide (PI) aron mahanduraw ang root meristem organization.Ang mga signal sa PI naobserbahan pinaagi sa fluorescence microscopy gamit ang TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems).
Ang histochemical staining sa mga gamot nga adunay β-glucuronidase (GUS) gihimo sumala sa protocol nga gihulagway ni Malami ug Benfey36.Ang mga semilya gitakda sa 90% nga acetone sa tibuok gabii, gipintalan sa 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid sa GUS buffer sulod sa 1 ka oras ug gibutang sa usa ka hydrated chloraldehyde solution.(8 g chloral hydrate, 2 ml nga tubig ug 1 ml glycerol) ug naobserbahan pinaagi sa differential interference contrast microscopy gamit ang Axio Imager M1 microscope (Carl Zeiss).
Ang mga anggulo sa gamut gisukod sa 7-ka-adlaw nga mga seedling nga gipatubo sa vertically nga gibutang nga mga plato.Sukda ang anggulo sa gamut gikan sa direksyon sa gravity vector sama sa gihulagway sa lakang 6.
Ang paghan-ay sa mga cortical microtubule naobserbahan sama sa gihulagway, nga adunay ginagmay nga mga pagbag-o sa protocol 37.Ang anti-β-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ug Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) gigamit isip primary ug secondary antibodies sa 1:1000 ug 1:100 dilutions, matag usa.Ang mga hulagway sa fluorescence nakuha gamit ang TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems).Pagkuha og Z-stack nga mga hulagway ug paghimo og maximum intensity projection sumala sa mga instruksyon sa tiggama.
Ang HeLa cell proliferation assay gihimo gamit ang Cell Counting Kit 8 (Dojindo) sumala sa mga instruksyon sa tiggama.
Ang pagtubo sa E. coli DH5α gisusi pinaagi sa pagsukod sa densidad sa selula sa kultura gamit ang spectrophotometer sa 600 nm (OD600).
Ang cytoskeletal nga organisasyon sa transgenic BY-2 nga mga selula naobserbahan gamit ang fluorescence microscope nga nasangkapan sa usa ka CSU-X1 confocal scanning device (Yokogawa) ug usa ka sCMOS camera (Zyla, Andor Technology).Ang densidad sa cytoskeletal gi-assess pinaagi sa pag-analisar sa imahe, nga gibanabana ang porsyento sa mga cytoskeletal nga mga piksel taliwala sa mga cytoplasmic nga mga piksel sa mga imahe nga confocal gamit ang ImageJ software sama sa gihulagway38,39.
Aron mahibal-an ang pagkamatay sa cell sa BY-2 nga mga selyula, usa ka aliquot sa suspensyon sa selyula gilumlom sa 0.05% nga asul nga Evans sa 10 minuto sa temperatura sa kwarto.Selective Evans asul nga pagmantsa sa patay nga mga selula nagdepende sa extrusion sa tina gikan sa buhi nga mga selula pinaagi sa intact plasma lamad40.Ang mga stained cell naobserbahan gamit ang bright-field microscope (BX53, Olympus).
Ang mga selula sa HeLa gipatubo sa DMEM nga gidugangan sa 10% FBS sa usa ka humidified incubator sa 37 ° C ug 5% CO2.Ang mga selula gitambalan sa 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng / ml colcemid (Gibco), o 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) sulod sa 6 ka oras sa 37 ° C.Ang mga selula giayo sa MetOH sa 10 min ug dayon sa acetate alang sa 5 min sa temperatura sa lawak.Ang mga naayos nga mga selyula gilusok sa β-tubulin primary antibody (1D4A4, Proteintech: 66240-1) nga lasaw sa 0.5% BSA/PBS sulod sa 2 ka oras, gihugasan 3 ka beses sa TBST, ug dayon gilumlom sa Alexa Fluor nga kanding nga antibody.4881 ka oras.– Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ug 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) lasaw sa 0.5% BSA/PBS.Pagkahuman sa paghugas gamit ang TBST tulo ka beses, ang mga stained cell naobserbahan sa usa ka Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope.Nakuha ang mga hulagway gamit ang gipabugnaw nga Hamamatsu ORCA-R2 CCD camera gamit ang MetaMorph software (Molecular Devices).
Oras sa pag-post: Hun-17-2024